[发明专利]液相色谱串联质谱检测新型心血管疾病风险标志物的方法

说明书

本发明属于临床生物样本检测技术领域，特别涉及一种高通量液相色谱串联质谱法检测生物样本中氧化三甲胺、胆碱、甜菜碱、肌酐和左旋肉碱的方法；该方法可以同时检测生物样本中5种物质，具有高准确度、高灵敏度、高特异性以及所需样本体积少、样本前处理简单及耐受性好等优点。

技术领域

本发明涉及高通量液相色谱串联质谱法检测生物样本中的氧化三甲胺、胆碱、甜菜碱、左旋肉碱和肌酐的方法。

背景技术

中国心血管病(cardiovascular disease，CVD)的患病率及死亡率持续上升，患病人数约2.9亿。CVD死亡率居各病因之首，占居民疾病死亡构成的40％以上。与此同时，中国心血管疾病负担日渐加重，已成为重大的公共卫生问题。随着社会经济的发展，国民生活方式发生了深刻的改变。在社会老龄化和城市化进程加快、居民不健康生活方式盛行的背景下，国民CVD危险因素普遍暴露，高血压、血脂异常、糖尿病的患病率持续增加，导致了中国CVD患病率和死亡率的不断上升，目前CVD 呈现在低龄化、低收入群体中快速增长趋势。今后十年我国CVD患病人数仍将持续增长，防控工作十分严峻。

降低CVD风险的一个重要步骤是识别和治疗已知的风险因素(如吸烟、血脂异常、高血压、饮食不良)。新的风险因素，如代谢物氧化三甲胺(TMAO)，有助于完善CVD风险评估，并可能成为CVD治疗干预的新目标物质。

循环系统中的TMAO与心血管疾病的各种病理生理过程有关。血液中的TMAO 水平与摄入的营养成分：如胆碱(Choline)、甜菜碱(Betaine)和左旋肉碱 (L-Carnitine)。肠道细菌将这些前体营养物质转化为三甲胺(TMA)，三甲胺随后在肝脏中氧化为TMAO。研究表明在啮齿类动物模型中，富含TMAO前体的饮食增加动脉粥样硬化引起的泡沫细胞，导致主动脉病变，抑制胆固醇从组织转移到肝脏，并改变血小板特性增加血栓形成的风险。

大量前瞻性队列的荟萃分析表明，高浓度的TMAO与主要不良冠状动脉事件(MACE)和死亡率的风险增加相关，并独立于其他风险因素。临床数据支持在接冠状动脉造影和急性冠状动脉综合征患者中，使用TMAO进行更准确的MACE风险预测。临床数据也支持使用TMAO来完善外周动脉疾病、心力衰竭、慢性肾病和心肌梗死患者的全因死亡率的风险评估。临床医生和研究人员可根据TMAO的影响，定义为指导饮食调整和治疗的工具。

肌酐(Creatinine)是肌肉在人体内代谢的产物，其水平与肾功能相关，长期高血压或血性心功能不全会引起肾损伤，进而使肌酐水平升高。

目前，长沙都正生物科技有限责任公司于2017年6月27日申请的中国专利“一种氧化三甲胺定量检测试剂盒及方法”，申请号201710502265.5，该发明公开一种测定氧化三甲胺的液相串联质谱方法，但是仅可测氧化三甲胺一种物质，且没有阐明应用价值。苏州帕诺米克生物医药科技有限公司于2018年9月13日申请的中国专利“一种测定小分子生物标志物的方法”，申请号201811068542.7，该发明公开一种测定11种小分子(胆碱、甜菜碱、左旋肉碱、氧化三甲胺、肌酐、同型半胱氨酸、亮氨酸/异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸)的液相串联质谱方法：由于一次检测多种物质，样本前处理复杂，且需要使用还原剂。常州市第一人民医院于2019年4月8日申请的中国专利“一种试剂盒”，申请号201910274765.7，该发明公开一种测定血浆TMAO含量的试剂盒，仅可测TMAO一种物质。

综上所述，现有技术关于新型心血管疾病风险标志物的方法检测的过程主要缺陷在于：

1、多数方法仅仅能检测TMAO一种物质，无法满足临床需求；

2、生物样本前处理方法太复杂，无法自动化，难以推广到临床应用；

3、检测标志物临床意义不明确，且无足够文献及数据支撑。

4、检测无关标志物太多，成本太高。

发明内容