[发明专利]一种人Legumain化学发光检测试剂盒及其应用

权利要求书

1.一种人Legumain化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括以下组分：

链霉亲和素化磁珠悬浮液；

吖啶酯标记的Legumain抗体；

生物素标记Legumain抗体；

化学发光底物液，包括A液和B液，所述A液为硝酸溶液，B液为氢氧化钠溶液；

校准品：浓度为0 pg/mL，10 pg/ mL、50 pg/mL、100 pg/mL、500 pg/mL、1000 pg/mL、2500 pg/mL的Legumain抗原；

质控品；

清洗液。

2. 如权利要求1所述的一种人Legumain化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述吖啶酯标记的Legumain抗体由以下步骤制备而成：将Legumain抗体放入离心管中室温离心10s～30s，离心后加入碳酸缓冲液，混匀后加入吖啶酯溶液再次进行室室温离心，离心后将离心管密封后放入避光暗盒中，然后将暗盒放入气浴恒温振荡器中混匀，25℃震荡混匀2 -4h，混匀后在离心管中加入封闭液，再次将暗盒放入气浴恒温振荡器中混匀封闭，封闭时间1-2h，将封闭好的抗体上葡聚糖凝胶G250柱纯化、用 PB缓冲液洗脱，收集，然后放入缓冲液中稀释，保存吖啶酯标记的Legumain抗体备用。

3. 如权利要求2所述的一种人Legumain化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述吖啶酯标记的Legumain抗体中Legumain抗体的质量(μg)：吖啶酯溶液的体积(μl)为100﹕1，所述吖啶酯溶液浓度为2mg/mL，所述封闭液为20％的赖氨酸；所述缓冲液为50mM MES、0.05％吐温-20和0.05％ Proclin300的混合液，pH = 6。

4.如权利要求1所述的一种人Legumain化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述链霉亲和素化磁珠悬浮液由以下步骤制备而成：

1) 将氯化铁和氯化亚铁在水中溶解混匀后，加入氨水，在50-70℃下反应3-5h，得到磁性微球；

2) 将步骤1)得到的磁性微球分散于50％乙醇中，之后同0.5％ PEG4000、0.1％氨水和0.1％正硅酸乙酯在60-65℃搅拌反应 14h-18h，得到改性后的磁性微球；

3) 将步骤2) 得到的改性后的磁性微球用超纯水和无水乙醇交替洗涤后重悬于 50％乙醇中，再分别加入0.05％氨水、0.5％四甲基氢氧化铵TMA和2.5％ 3－氨丙基三甲氧基硅烷，在室温搅拌反应14h-18h，得表面修饰氨基的磁性微球；

4) 将步骤3) 得到表面修饰氨基的磁性微球用PBS缓冲液清洗并重悬再加入0.1％TMA、 2.5％戊二醛在室温下搅拌反应30-40min，之后用碳酸缓冲液清洗并重悬超声分散后按 20ug/mg磁性微球加入SA，37℃搅拌反应14h-18h，加入0.1％谷氨酸和1％BSA继续反应1- 2h，反应后，利用含0.05％的Tween-20的PBS缓冲液洗涤3次后重悬于1％BSA中超声分散即得SA磁性微球，加入磁微粒保存液于2～8℃保存，得到链霉亲和素化磁珠得到链霉亲和素化磁珠悬浮液备用。

5. 如权利要求1所述的一种人Legumain化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述生物素标记Legumain抗体由以下步骤制备而成：利用 pH6.5的Tris缓冲液将Legumain抗体透析纯化后，加入已活化的长链磺化生物素，2 - 8℃反应1-3h，再转入室温继续反应10-30min，最后加入赖氨酸反应10 -30min，经纯化，加入等体积甘油和0.1% NaN ₃或0.1%Proclin300，得到偶联标记物标记的Legumain抗体。

6.如权利要求4所述的一种人Legumain化学发光检测试剂盒，其特征在于，步骤1）中氯化铁和氯化亚铁摩尔比为2﹕1；步骤2）的PEG4000、氨水和正硅酸乙酯的体积比为1﹕5﹕1；步骤3）的氨水、四甲基氢氧化铵TMA和3-氨丙基三甲氧基硅烷的体积比为5﹕2﹕4；步骤4）中TMA、戊二醛、SA、谷氨酸、BSA的体积比为2﹕3﹕10﹕1﹕1。