[发明专利]一种A型肉毒毒素抑制剂及其制备方法与应用

说明书

本发明公开了一类新型A型肉毒毒素轻链多肽类抑制剂及其制备方法与应用。所述多肽类抑制剂的结构式如式I所示。本发明通过Fmoc‑固相肽合成法得到线性肽，然后酰胺化关环，纯化后得到目标物。各抑制剂对A型肉毒毒素轻链抑制IC₅₀处于0.37～3.1μM，能显著延长A型肉毒毒素中毒小鼠的死亡时间。本发明对A型肉毒毒素的中毒治疗具有应用价值。

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种A型肉毒毒素抑制剂及其制备方法及其应用。

背景技术

肉毒毒素(Botulinum neurotoxins，BoNTs)是由革兰氏阳性菌肉毒梭菌(Clostridium botulinum)分泌的外毒素，是迄今为止人类发现的毒性最强的生物毒素，被列为重要的生物战剂之一。人类发现的肉毒毒素分为7种血清型(A～G)，其中A、B、E、F型可引起人群中毒，以A型毒性最强且最为常见。其结构可分为重链与轻链。重链可与靶细胞膜表面特异性受体结合，介导轻链进入靶细胞。轻链为其毒性成分，可特异性切割SNARE家族蛋白，阻止乙酰胆碱递质的释放，阻断了神经冲动的传导，引起肌肉麻痹(Duplantier AJ，et al.Curr Top in Chem 2016；16(21):2330-49)。

人类肉毒毒素中毒类型可分为四种(Atassi MZ，et al.Crit Rev Immunol 1999；19(3):219-60)：(1)食源性肉毒毒素中毒；(2)婴儿肉毒毒素中毒；(3)吸入性中毒；(4)创伤性肉毒毒素中毒。目前食源性及婴儿肉毒中毒事件仍时有发生。随着A型肉毒毒素(BoNT/A)在医疗和美容的广泛应用，因使用不当导致的肉毒中毒事件时有发生。

目前A型肉毒中毒采取马抗进行治疗，然而马抗存在过敏反应、生产成本高以及低温储存等缺点，且抗毒素只能中和体液、血液中游离毒素，对细胞内的毒素则无抑制效果。肉毒毒素往往在中毒数小时内便可进入神经元，能在神经元中存在数天甚至数月，持续性切割SNARE家族蛋白，阻断乙酰胆碱递质的释放。胞内毒素只能通过人体自身降解被清除，使得病人的治疗周期很长(Thanongsaksrikul J，et al.Toxins 2011；3(5):469-88)。因此，有必要开发小分子抑制剂用于A型肉毒中毒治疗。

CPI-1(序列：Dab-(C)RWTKCL-NH₂)是目前已知的活性最强BoNT/A轻链多肽类抑制剂(K_i＝39.2±4.6nmol/L)，为含7个天然氨基酸与一个非天然氨基酸Dab(L-2,4-二氨基丁酸)的环肽(Adler M，et al.Bioorg Med Chem,2015,23(22):7264-73)。具有作用靶点专一，亲和力较高，水溶性好等优点。然而CPI-1二硫键容易在体内被还原而导致活性丧失。

发明内容

为解决CPI-1易在体内还原且抗酶解活性较差的缺点，本发明提供了一类新型抑制剂，该类抑制剂比CPI-1的抗酶解能力更强，体外抑制BoNT/A轻链的活性比CPI-1稍低(见表1)，但体内对BoNT/A的解毒显著效果优于CPI-1(见表2)。同时，对多肽进行改造，在其C端引入疏水氨基酸或碱性氨基酸，进一步提高了突变肽的抑制活性(见表1)。

本发明还提供了上述抑制剂在制备A型肉毒毒素解毒剂中的应用。

本发明所采取的技术方案为通过设计一个包含胱硫醚或双氨基的linker，对CPI-1序列中半胱氨酸的位置进行替换，引入碳碳键或碳硫键替换二硫键作为骨架结构，进一步在多肽的C端引入疏水氨基酸及碱性氨基酸。

本发明所提供的新型环状多肽抑制剂的序列通式如下：

Dab-RWTK-X-L-Z-NH₂

其中：Dab代表L-2,4-二氨基丁酸，R代表精氨酸，W代表色氨酸，T代表苏氨酸，K代表赖氨酸，L代表亮氨酸；