[发明专利]一种鲤科鱼类肝细胞的快速分离方法

权利要求书

1.一种鲤科鱼类肝细胞的快速分离方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)获取鱼肝脏，取部分肝块，将其切成肝片，并对其进行冲洗；

(2)将冲洗后的肝片切碎，得肝碎块，向肝碎块中加入汉克斯平衡盐溶液，然后在26-28℃条件下以100次/min的频率震荡15-20min，然后在离心力为100g的条件下离心15s，得沉淀；

(3)向步骤(2)所得沉淀中加入由CaCl₂、牛血清白蛋白、胶原酶、分散酶、胰酶抑制剂、脱氧核糖核酸酶Ⅰ和汉克斯平衡盐溶液组成的消化液于26-28℃条件下以220次/min的频率震荡20-30min，消化液与沉淀的体积质量比为3:1，然后对其进行吹打，静置，待大块组织沉淀后，上层细胞悬液过200目细胞筛，收集细胞混悬液，其中，消化液中CaCl₂的摩尔浓度为5mmol/l，牛血清白蛋白的质量浓度为0.1g/ml，胶原酶的质量浓度为1mg/ml，分散酶的质量浓度为22ug/ml，胰酶抑制剂的质量浓度为50ug/ml，脱氧核糖核酸酶Ⅰ的质量浓度为75ug/ml；

(4)向步骤(3)中剩余大块组织中加入由CaCl₂、牛血清白蛋白和汉克斯平衡盐溶液组成的清洗液，然后对其进行吹打，静置，待大块组织沉淀后，上层细胞悬液过200目细胞筛，收集得细胞混悬液，重复该步骤3次，并合并细胞混悬液；

(5)将步骤(3)和(4)中收集的细胞混悬液进行离心，先在100g的条件下离心4min，再在100g离心力的条件下离心2min，得细胞沉淀，然后加入由CaCl₂、牛血清白蛋白和汉克斯平衡盐溶液组成的清洗液进行清洗，离心，重悬，制得原代肝细胞，其中，清洗液中CaCl₂的摩尔浓度为5mmol/l，牛血清白蛋白的质量浓度为0.03g/ml，所述汉克斯平衡盐溶液中不含钙镁离子。