[发明专利]一种利用ddPCR技术联合检测诊断乳腺癌的方法

说明书

本发明公开了一种利用ddPCR技术联合检测诊断乳腺癌的方法，具体包括以下步骤：S1、提取样本中基因组DNA及miRNA，S2、DNA亚硫酸盐修饰和纯化定量，将miRNA逆转录成cDNA，S3、以纯化后的DNA基因组为模板、特异性引物为引物分别进行ddPCR，用来检测MASPIN甲基化状态，S4、计算待测样本maspin编码序列上游调控区域CpG岛的甲基化程度W，并与样本中miR‑142含量联合分析，本发明涉及生物和疾病诊断技术领域。该利用ddPCR技术联合检测诊断乳腺癌的方法，可实现通过将maspin基因甲基化状态及miR‑142含量这两种指标联合检测用来评定是否患者换上乳腺癌的依据，数据更精确，结果更可靠，可广泛应用于乳腺癌早期筛查，有效辅助判断乳腺癌恶性程度和是否转移。

技术领域

本发明涉及生物和疾病诊断技术领域，具体为一种利用ddPCR技术联合 甲基化特异性PCR检测基因maspin甲基化状态和miR-142相对含量诊断乳腺 癌的方法。

背景技术

目前，乳腺癌筛查最常用的影像学方法是钼靶X线和超声。乳腺钼靶， 全称乳腺钼靶X线摄影检查，又称钼钯检查，是目前诊断乳腺疾病的首选和 最简便、最可靠的无创性检测手段，痛苦相对较小，简便易行，且分辨率高， 重复性好，留取的图像可供前后对比，不受年龄、体形的限制，目前已作为 常规的检查。它的特点是可以检测出医生触摸不到的乳腺肿块，特别是对于 大乳房和脂肪型乳房，其诊断性可高达95％，对于以少许微小钙化为唯一表 现的T0期乳腺癌(临床门诊阴性)，也只有凭借软X线检查才能被早期发现 和诊断，对乳腺癌的诊断敏感性为82％～89％，特异性为87％～94％。但乳腺 钼靶对肿瘤风险较高的致密性乳腺敏感度不高。超声检查简便易行，对浸润 性乳腺癌较钼靶X线检查敏感。随着超声弹性成像、超声造影、超声三维成 像等超声影像学新技术的迅猛发展及应用，超声波检查在乳腺癌的早期诊断 中发挥越来越重要的作用，随着对乳腺癌研究的深入，钼靶X线和超声检查 等现有检测诊断技术仍有以下明显短板：

(1)不能检测早期原位乳腺癌的发生，即当乳腺癌发生早期没有形成明 显肿瘤或者肿瘤块较小时，很难检测到。

(2)很难预测乳腺癌是否会转移。

(3)很难检测乳腺癌的早期转移。

总之，现有检测技术已不能满足临床医师对肿瘤患者进行术前病理组织 学分级、预估肿瘤分子分型的要求。

失去对增殖的控制和对细胞凋亡/坏死的抗性被认为是包括乳腺癌在内的 许多癌症类型的标志。在原发性肿瘤形成之后，可能发生转移，由此细胞获 得迁移能力，侵入周围组织，进入血液和淋巴系统，然后渗出并定植于二级 位点。转移部位的复发是乳腺癌患者死亡的主要原因。

Maspin是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，是蛋白酶抑制剂serpin家族的成员， 可作为肿瘤抑制基因，maspin已被证明可抑制细胞运动、侵袭和转移。maspin 基因表达的丧失是乳腺癌中的常见事件，其导致侵袭潜力增加和转移性疾病 的传播。乳腺癌细胞中maspin基因表达的丧失不是由于maspin基因的丢失或 重新排列，而是由于调节maspin表达的因子在癌症进展期间被破坏。肿瘤抑 制基因启动子中CpG二核苷酸的异常胞嘧啶甲基化通常与其致癌作用和癌症 进展过程中染色质结构的变化及其转录沉默有关。研究表明，DNA高甲基化 导致人乳腺癌中maspin基因的沉默。

miR-142是miRNA家族成员之一在多种恶性肿瘤中表达异常，推测其在 恶性肿瘤的发生发展中发挥重要作用。有研究显示乳腺癌组织中miR-142表 达低于癌旁组织，并且乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-468中miR-142表达均低于正常乳腺上皮细胞HBL-100。这说明miR-142异常表达 与乳腺癌的发生有关，可能在乳腺癌的发生中起着抑癌基因的作用。