[发明专利]抗白粉病的葡萄钙依赖蛋白激酶基因VpCDPK13及其应用

说明书

本发明专利申请公开了中国野生华东葡萄白河‑35‑1钙依赖蛋白激酶基因VpCDPK13及其应用。本申请涉及基因工程领域，尤其是涉及葡萄抗病育种领域。通过基因克隆技术从抗病的中国野生华东葡萄白河‑35‑1植株基因组分离获得了钙依赖蛋白激酶基因VpCDPK13，并将该基因转入到白粉病易感葡萄植株中获得了抗白粉病的转基因葡萄植株，提高了葡萄的抗白粉病能力。

技术领域

本发明专利申请属于植物抗逆基因鉴定及基因工程技术领域，尤其是抗白粉病的葡萄钙依赖蛋白激酶基因的分离和鉴定，更具体地涉及一个从中国野生华东葡萄白河-35-1分离的抗白粉病的葡萄钙依赖蛋白激酶基因VpCDPK13及其抗白粉病的应用。

背景技术

白粉病是严重危害葡萄生产的重要真菌病害，常导致严重减产甚至绝收，造成巨大经济损失。为防控该病，生产上每年需要喷洒农药20-30次，严重影响葡萄产品的食用安全，威胁人体健康，污染生态环境(Gadoury等人，2012)。目前，葡萄育种者越来越强烈地认识到，尽快挖掘利用野生葡萄的抗病基因，积极开展葡萄精准抗病分子育种，是从根本上解决这一问题的重要途径。

钙离子是真核生物细胞中重要的第二信使。钙依赖蛋白激酶(CDPKs)是植物中一类特殊的钙信号解码蛋白，可独立完成钙信号的解码和传递。当植物细胞遭受胁迫时，细胞膜上的受体蛋白识别胁迫信号后会迅速激活钙离子通道，质外体空间的钙离子大量内流导致细胞质中钙离子浓度升高。CDPKs羧基端的EF-hand结构域结合钙离子后促使CDPKs发生构象改变，暴露其激酶活性中心，此时，CDPKs可以与底物蛋白相互作用并将其磷酸化，对下游底物蛋白的活性或稳定性进行调控。上述过程将钙信号(细胞质钙离子浓度振荡)转化为磷酸化事件，实现了胁迫信号的传递与处理，因此，CDPKs蛋白在植物生长发育与逆境胁迫响应过程中发挥重要调控作用(Sheen，1996)。

钙依赖蛋白激酶(CDPKs)以基因家族形式存在于葡萄基因组中。然而，到目前为止，关于葡萄钙依赖蛋白激酶(CDPKs)的研究很少，更没有关于具有抗白粉病功能的葡萄钙依赖蛋白激酶的报道和研究。这可能是因为抗白粉病的葡萄品种资源匮乏，大多数葡萄品种都是易感白粉病的。例如，葡萄基因组首次测序所采用的欧亚种葡萄品种黑比诺葡萄(PinotNoir)以娇贵而闻名，它为许多世界佳酿(如罗曼尼·康帝)葡萄酒所采用。然而包括该葡萄在内的大多数欧亚种葡萄品种易遭受白粉病等病害的侵害(Amrine等人，2015；Gao等人，2016；Yin等人，2017)。

野生华东葡萄(Vitis pseudoreticulata)是我国特有的葡萄野生种。西北农林科技大学野生葡萄种质资源圃中保存的华东葡萄株系白河-35-1对葡萄白粉病、霜霉病等主要葡萄病害表现出较高抗性，但其具体的遗传学基础(抗病基因)目前并不清楚(Gao等人，2016；Yin等人，2017)。本文以白粉病易感品种黑比诺葡萄(参考基因组)的钙依赖蛋白激酶基因VpCDPK13为参考，设计特异引物，采用基因克隆技术从华东葡萄株系白河-35-1基因组cDNA文库中克隆获得了分离的抗白粉病的钙依赖蛋白激酶基因，其为葡萄抗白粉病精准分子育种提供基因资源和分子标记具有重要理论价值和实践意义。

发明内容

本发明专利申请从中国野生华东葡萄白河-35-1分离获得了钙依赖蛋白激酶(CDPKs)基因VpCDPK13，并证明该基因具有抗白粉病功能。本申请还涉及VpCDPK13用于葡萄抗白粉病的用途。

在一个实施方案中，本申请的分离的抗白粉病的葡萄钙依赖蛋白激酶基因VpCDPK13具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

本发明专利申请的一个方面涉及分离的抗白粉病的葡萄钙依赖蛋白激酶，其由本申请所述的分离的抗白粉病的钙依赖蛋白激酶基因VpCDPK13编码，所述钙依赖蛋白激酶具有SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。