[发明专利]PET降解生物催化剂及其应用

权利要求书

1.PET降解全菌催化剂，其特征在于：所述PET降解全菌催化剂由PET酶在耐热菌株中表达得到；所述PET酶的序列如SEQ NO.1所示；所述耐热菌株为热纤梭菌（Clostridiumthermocellum）。

2.如权利要求1所述的PET降解全菌催化剂的构建方法，其特征在于：包括①质粒表达PET降解酶、②基因组表达PET降解酶和③表达PET降解小体；所述PET降解小体由带组装模块的LCC和MHETase与带粘连模块的脚架蛋白通过蛋白质间的特异性相互作用实现胞外组装得到。

3.根据权利要求2所述的PET降解全菌催化剂的构建方法，其特征在于：所述①质粒表达PET降解酶的具体步骤为：（1a）利用pHK质粒构建具有PET降解酶表达框的表达质粒pLCC；（1b）将表达质粒转化到热纤梭菌（Clostridium thermocellum）中，得到转化子；（1c）对转化子中PET降解酶编码基因进行PCR和测序验证，并进行胞外蛋白的酶活测定，获得质粒表达PET降解酶的全菌催化剂。

4.根据权利要求3所述的PET降解全菌催化剂的构建方法，其特征在于：所述步骤（1a）中的PET降解酶表达框是从5’端到3’端依次具有启动子I、信号肽和PET降解酶编码基因的序列；所述步骤具体为：利用分子克隆的方法将信号肽序列连接到PET降解酶编码基因的5’端，然后连接到pHK质粒的启动子I的3’端；所述pHK质粒是同时带有大肠杆菌和梭菌的复制子的穿梭质粒，具有氯霉素和甲砜霉素抗性基因。

5.根据权利要求2所述的PET降解全菌催化剂的构建方法，其特征在于：所述②基因组表达PET降解酶的具体步骤为：（2a）将具有LCC和MHETase序列的融合表达框作为目标基因克隆到同源重组质粒pHK-HR中；（2b）选取16SrRNA基因序列为靶位点，采用无疤敲除及筛选方法，将融合表达框整合到热纤梭菌基因组上，获得基因组融合表达LCC和MHETase的菌株；（2c）通过胞外蛋白的酶活测定，确认PET降解酶是否成功表达，获得基因组表达PET降解酶的全菌催化剂。

6.根据权利要求2所述的PET降解全菌催化剂的构建方法，其特征在于：所述③表达PET降解小体的具体步骤为：（3a）构建共转录表达LCC和MHETase的质粒pLa-Mf，LCC和MHETase分别融合来源于丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum）和黄色纤维梭菌（Clostridium clariflavum）的组装模块；（3b）将pLa-Mf中的共转录表达框作为目标基因克隆到同源重组质粒pHK-HR中，选取16SrRNA基因序列为靶位点，采用无疤敲除及筛选方法，整合到热纤梭菌基因组上，分别获得基因组共转录表达LCC和MHETase的菌株；（3c）利用启动子II和信号肽构建表达降解小体脚架的质粒pSca，并将其转化到所述的基因组共转录表达LCC和MHETase的菌株中；（3d）通过胞外蛋白的酶活测定，确认PET降解酶是否成功表达，从而获得基于PET降解小体的全菌催化剂。

7.根据权利要求6所述的PET降解全菌催化剂的构建方法，其特征在于：步骤（3a）具体为：利用pHK质粒构建具有PET降解酶表达框的表达质粒pLCC；所述pLCC质粒的LCC编码基因的3’端融合表达来自丙酮丁醇梭菌的组装模块DocCa，获得质粒pLa；在质粒pLa中DocCa序列之后顺序插入RBS序列、MHETase的编码基因以及来自黄色纤维梭菌的组装模块DocCf的基因，获得质粒pLa-Mf；步骤（3c）中构建质粒pSca具体为：按照启动子II、信号肽、来自丙酮丁醇梭菌的粘连模块、来自黄色纤维梭菌的粘连模块的顺序利用分子克隆的方式获得融合序列，并克隆到质粒pHK中，获得表达降解小体脚架的质粒pSca。