[发明专利]一种西番莲内参基因及其专用引物和应用

说明书

本发明公开了一种西番莲内参基因及其专用引物和应用，属于植物分子生物学技术领域。本发明提供的西番莲内参基因为EF1基因，其基因序列如SEQ ID NO.1所示。本发明通过西番莲的转录组测序库，挑选了10个候选参考基因，并依此设计了实时荧光定量引物，经过筛选，得到以上所述内参基因，在不同算法和不同样本处理的9种情况中，EF1稳定性在五种条件下稳定性排名第一和第二，其余四种情况下排名第三至第五，稳定性也较好。本发明不仅解决了现有西番莲检测中没有内参基因的现状，而且所设计的实时荧光定量引物用于西番莲组织中基因表达分析时引物特异性强，从提高了实时荧光定量检测西番莲基因时的检测效率和检测结果的可信度。

技术领域

本发明属于植物分子生物学技术领域，更具体地说，涉及一种西番莲(Passifloraedulis)内参基因及其专用引物和应用。

背景技术

实时荧光定量PCR(qRT-PCR)由于其灵敏度强、重复性高、特异性强、快速、高效性等特点，成为研究基因表达的主要方法。然而，qRT-PCR可能受到RNA纯度，数量和反转录效率的影响。因此，通常需要引入内参基因作为标准以准确量化基因表达。内参基因是一类组成性表达基因，并且对于维持细胞基本生命活动至关重要。理想情况下，内参基因在个体的不同组织器官、不同生长发育阶段或不同试验条件处理下均能持续稳定表达，不会受到任何内源性或外源性环境因素的影响。近年来关于内参基因的报道日益增多，已经鉴定出合适内参基因物种有：拟南芥、杨树(Populus trichocarpa)、豌豆(Pisum sativum L.)、大豆(Glycine max)、马铃薯(Solanum tuberosum)、番茄(Lycopersicon esculentum Mill)、小麦(Triticum aestivum)、黑麦草(Lolium perenne)、马尾松(Pinus massoniana L.)、紫薇(Lagerstroemia indica)、油菜(Brassica napus)等。

不同物种和不同样本间内参基因的稳定性存在一定差异。18S被鉴定为水稻(Oryza sativaL.)和杨树稳定的内参基因，但18S是桃(Amygdalus persica)中最不稳定的基因；UBQ在桃和香蕉(Musa nana)果实不同发育阶段表达稳定，但在葡萄果实不同发育阶段表达不稳定。绿藻(Chlorophyta)在盐胁迫和紫外线处理下TUB2表达稳定，然而在不同温度和干燥胁迫处理下Histone2为最适合的内参基因。如果内参基因选取不当会对实验结果造成严重影响，甚至的得到错误结论，当选用合适的内参基因APT1、UBQ5、EF1a对拟南芥目标基因At5g02840进行校准时，At5g02840在整个豆荚发育阶段中表达量基本一致，而选用不合适的内参基因TUB6对At5g02840进行校准时，At5g02840的表达量出现100倍的偏差^[153]。因此，在使用qRT-PCR进行表达分析前有必要先选则合适的内参基因。由于西番莲的分子研究较少，尚未有一个比较稳定的内参基因，因此有必要鉴定出稳定的西番莲的内参基因用于西番莲的基因表达研究。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题之一在于提供一种西番莲内参基因，能够应用在西番莲荧光定量实验中。本发明所要解决的另一技术问题是提供上述内参基因的专用引物。本发明最后所要解决的技术问题是提供上述内参基因在西番莲荧光定量中的应用。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种西番莲内参基因，为EF1基因，其基因序列如SEQ ID NO.1所示。

所述的EF1基因作为西番莲不同组织的荧光定量内参基因。

所述的EF1基因作为西番莲冷胁迫下的荧光定量内参基因。

所述的EF1基因的引物序列如下：

EF1正向引物5′-GGCTGAGCGTGAACGTGGTA-3′