[发明专利]用于蛋白质-蛋白质相互作用筛选的系统

说明书

本文描述了用于研究蛋白质‑蛋白质相互作用的方法和系统。这些系统利用彼此可互补的多肽的非功能性片段在体内形成功能性完全的片段。功能性完全的多肽释放可以结合并激活或抑制报道元件的转录调控多肽。

交叉引用

本申请要求于2018年12月7日提交的美国临时申请号62/776,992的权益，该申请通过引用并入本文。

发明内容

本文描述了用于研究蛋白质-蛋白质相互作用、筛选蛋白质-蛋白质相互作用的拮抗剂或激动剂或者发现新的蛋白质-蛋白质相互作用的核酸、系统和方法。这些核酸和系统用于筛选信号传导通路的小分子或生物激动剂或拮抗剂，诸如G蛋白偶联受体、受体酪氨酸激酶、离子通道和核受体。在一方面，该系统包括编码以下蛋白质的核酸：a)与可以切割靶序列或可被内源性酶切割的酶的非功能性片段融合的诱饵蛋白；b)与可以切割靶序列或可被与a)中的酶或靶序列互补的内源性酶切割的酶的非功能性片段以及转录调控蛋白融合的猎物蛋白(例如，测试蛋白)；以及c)在可被转录调控蛋白结合的调控元件控制下的报道基因。诱饵和猎物的缔合复原功能性完全的酶或靶序列，该酶或靶序列允许转录调控蛋白被切割并激活报道基因。在该系统中，报道基因包含唯一分子标识符(UMI)，其对于每个单独的猎物蛋白是唯一的。这使得可以研究任何给定刺激对诱饵和猎物相互作用的影响的多重性测定能够实现。

在一方面，本文描述了一种用于蛋白质-蛋白质相互作用筛选的系统，包括：(a)编码诱饵多肽的第一核酸，所述诱饵多肽与遍在蛋白多肽(ubiquitin polypeptide)的第一片段偶联；(b)编码猎物多肽的第二核酸，所述猎物多肽与遍在蛋白多肽的第二片段和转录调控多肽偶联；以及(c)包含报道元件的第三核酸，其中所述报道元件包括调控元件、第一报道基因和第二报道基因，其中所述调控元件被配置为被所述转录调控多肽结合，其中所述第二报道基因编码对所述猎物多肽唯一的RNA序列；其中当所述诱饵多肽与所述猎物多肽相互作用时，所述遍在蛋白多肽的第一片段和所述遍在蛋白多肽的第二片段形成可切割的遍在蛋白分子，接着所述可切割的遍在蛋白分子被脱遍在蛋白化酶切割，所述转录调控多肽从所述诱饵多肽释放，并启动所述第一报道基因和所述第二报道基因的转录。在某些实施方案中，所述遍在蛋白多肽的第一片段是遍在蛋白多肽的C-末端片段并且所述遍在蛋白多肽的第二片段是遍在蛋白多肽的N-末端片段。在某些实施方案中，所述遍在蛋白多肽的第一片段是遍在蛋白多肽的N-末端片段并且所述遍在蛋白多肽的第二片段是遍在蛋白多肽的C-末端片段。在某些实施方案中，所述转录调控多肽包含合成转录因子。在某些实施方案中，所述合成转录因子包含Gal4 DNA结合域和-VPR激活域的融合物。在某些实施方案中，所述诱饵多肽或所述猎物多肽是膜结合信号传导多肽。在某些实施方案中，所述膜结合诱饵多肽或所述猎物多肽包含G蛋白偶联受体、受体酪氨酸激酶或离子通道。在某些实施方案中，所述膜结合诱饵多肽或所述猎物多肽包含G蛋白偶联受体。在某些实施方案中，所述诱饵多肽或所述猎物多肽是细胞内信号传导多肽。在某些实施方案中，所述细胞内诱饵多肽或所述猎物多肽包含核激素受体。在某些实施方案中，所述诱饵多肽或所述猎物多肽包含可能与所述信号传导多肽相互作用的细胞内分子。在某些实施方案中，所述调控元件包括诱导型调控元件。在某些实施方案中，所述诱导型调控元件包含Gal4上游激活序列(Gal4UAS)。在某些实施方案中，所述第一报道基因编码荧光蛋白、萤光素酶蛋白、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸酶、氯霉素乙酰转移酶或分泌型胎盘碱性磷酸酶。在某些实施方案中，所述第一报道基因编码荧光蛋白或萤光素酶蛋白。在某些实施方案中，所述第一核酸包含编码无启动子荧光蛋白的序列。在某些实施方案中，所述荧光蛋白是绿色荧光蛋白。在某些实施方案中，所述第一核酸包含指导向基因组中的位点特异性整合的序列。在某些实施方案中，所述第一核酸包含指导向基因组中的位点特异性整合的attB序列。在某些实施方案中，所述第二核酸包含编码选择性表面标志物的序列。在某些实施方案中，所述选择性表面标志物是血凝素多肽。在某些实施方案中，本文描述了包含所述第一核酸、所述第二核酸和/或所述第三核酸的细胞。在某些实施方案中，所述第一核酸、所述第二核酸和/或所述第三核酸被整合在转座元件的整合位点处。在某些实施方案中，所述第一核酸、所述第二核酸和/或所述第三核酸被整合在预定的基因组位置。在某些实施方案中，本文描述了一种用于检测测试物质对蛋白质-蛋白质相互作用的影响的方法，包括使包含本文所述的系统的细胞或细胞群接触所述测试物质。在某些实施方案中，所述测试物质是化学品。