[发明专利]遗传修饰细胞的减少和最少的操作制造

权利要求书

1.一种遗传修饰生物样品中的造血干细胞和祖细胞(HSPC)群体的方法，其包括向所述生物样品添加金纳米颗粒(AuNP)，其中所述AuNP包含

直径小于20nm的金(Au)核心；

成簇规则间隔短回文重复序列(CRISPR)指导RNA(crRNA)-核酸酶核糖核蛋白(RNP)复合物，其中所述crRNA包含3’末端和5’末端，其中所述3’末端缀合到具有硫醇修饰的间隔物，并且所述5’末端缀合到所述核酸酶，并且其中所述硫醇修饰共价连接到所述Au核心的表面，并且其中所述crRNA具有如SEQ ID NO：262；SEQ ID NO：13；SEQ ID NO：14；或SEQ IDNO：241-261中所示的序列；

带正电荷的聚乙烯亚胺聚合物涂层，其中所述带正电荷的聚乙烯亚胺聚合物具有小于2500道尔顿的分子量，包围所述RNP复合物，并且接触所述Au核心的表面；以及

供体模板，其在所述带正电荷的聚合物涂层的表面上包含同源定向修复模板(HDT)，其中所述HDT模板包含如SEQ ID NO：48；SEQ ID NO：4；SEQ ID NO：15；SEQ ID NO：33-41；SEQID NO：44-47；或SEQ ID NO：49-51中所示的序列；以及

包含抗体克隆REA820、REA753、REA816、293C3、AC141、AC133或7的结合结构域的CD133靶向配体

其中所述靶向配体通过胺-巯基交联剂或巯基-巯基交联剂与所述核酸酶连接并且

其中所述HSPC群体未暴露于电穿孔、编码HDT的病毒载体或磁性细胞分离过程，并且其中所述方法导致不多于30％的HSPC细胞毒性并且在所述HSPC群体内提供至少10％的基因编辑效率。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述crRNA靶向如SEQ ID NO：25；SEQ ID NO：3；SEQID NO：24；SEQ ID NO：26-32；SEQ ID NO：42；SEQ ID NO：43；或SEQ ID NO：214-224中所示的序列。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述crRNA具有如SEQ ID NO：262、SEQ ID NO：261或SEQ ID NO：259中所示的序列。

4.如权利要求1所述的方法，其中所述核酸酶包括Cpf1或Cas9。

5.如权利要求1所述的方法，其中所述带正电荷的聚合物涂层包含

分子量为2000道尔顿的聚乙烯亚胺。

6.如权利要求1所述的方法，其中Au核心与核酸酶的重量/重量(w/w)比为0.6。

7.如权利要求1所述的方法，其中Au核心与HDT的w/w比为1.0。

8.一种遗传修饰生物样品中所选细胞群体的方法，其包括向所述生物样品添加金纳米颗粒(AuNP)，其中所述AuNP包含

直径小于30nm的金(Au)核心；

指导RNA(gRNA)-核酸酶核糖核蛋白(RNP)复合物，其中所述gRNA包含3’末端和5’末端，其中所述3’末端缀合到具有化学修饰的间隔物，并且所述5’末端缀合到所述核酸酶，并且其中所述化学修饰共价连接到所述Au核心的表面；

带正电荷的聚合物涂层，其中所述带正电荷的聚合物具有小于2500道尔顿的分子量，包围所述RNP复合物，并且接触所述Au核心的表面；以及

供体模板，其在所述带正电荷的聚合物涂层的表面上包含同源定向修复模板(HDT)

其中所述所选细胞群体未暴露于电穿孔或编码的病毒载体，并且其中所述方法导致不多于30％的所述所选细胞群体的细胞毒性并且在所述所选细胞群体内提供至少10％的基因编辑效率。

9.如权利要求8所述的方法，其中Au核心与核酸酶的重量/重量(w/w)比为0.6。

10.如权利要求8所述的方法，其中Au核心与HDT的w/w比为1.0。