[发明专利]单细胞全转录组分析中的选择性延伸

说明书

本文的公开内容包括用于选择性地扩增和/或延伸样品中的核酸靶分子的方法和组合物。该方法和组合物可以例如减少样品中不期望的核酸种类的扩增和/或延伸，和/或允许选择性去除样品中不期望的核酸种类。

相关申请

本申请根据35 U.S.C.§119(e)，要求2018年12月13日提交的美国临时专利申请序列第62/779,374号的权益，该相关申请的内容出于所有目的通过引用以其整体并入本文。

背景

领域

本公开内容总体上涉及分子生物学领域，例如分子条形码化(molecularbarcoding)。

对现有技术的描述

生物样品中不同基因的表达水平可能有显著差异。例如，基因表达的一些大类有：1)“高表达者”，包括5-10个基因，占细胞mRNA的～20％；2)“中等(intermediate)表达者”，包括50-200个基因，占细胞mRNA的40％-60％；和3)“温和(moderate)表达者”，包括10,000-20,000个基因，占细胞mRNA分数的其余部分。分子生物学和分子遗传学中的一个挑战是高效和准确地捕获这种高度动态的基因表达谱，以便区分样品中的不同细胞类型和表型。

下一代测序(NGS)为评估基因表达谱提供了一种高通量的方法。在为NGS准备文库的过程中，通过PCR扩增具有异质cDNA种类的样品，以获得足够的样品量并连接NGS相容的衔接子。测序过程从PCR扩增的文库样品捕获每个基因的读段数量，以解释基因表达水平。然而，由于不同的基因在很大水平范围内表达，PCR扩增会扭曲天然基因的表达。例如，含有一个分子cDNA的基因将需要40个循环的PCR才能获得与含有1000个分子cDNA的基因在30个循环中获得的相同的代表量。在异质的cDNA样品中，PCR通常以过量的循环进行，以充分扩增低表达者；在这些情况下，天然基因表达谱通常被主要的高表达者PCR产物所扭曲。纠正PCR产物中这种偏差的一种方法是分子索引(Molecular Indexing)；然而，高表达者诸如核糖体蛋白mRNA、线粒体mRNA或看家基因通常在测序运行中占主导地位，对实验解释的贡献很小。对选择性地延伸和/或扩增感兴趣的序列存在需求。

概述

本文的公开内容包括一种选择性延伸的方法。在一些实施方案中，该方法包括获得包含多于一种核酸靶分子和一种或更多种不期望的核酸种类的样品；将封闭寡核苷酸与样品接触，其中封闭寡核苷酸特异性地结合一种或更多种不期望的核酸种类中的至少一种；将多于一种寡核苷酸探针与样品接触，其中多于一种寡核苷酸探针中的每一种包含分子标记序列和能够与多于一种核酸靶分子和一种或更多种不期望的核酸种类杂交的靶结合区；以及延伸与多于一种核酸靶分子和一种或更多种不期望的核酸种类杂交的寡核苷酸探针，以产生多于一种延伸产物；由此一种或更多种不期望的核酸种类中的至少一种的延伸被封闭寡核苷酸减少。

封闭寡核苷酸可以在多于一种寡核苷酸探针与样品接触之前或之后与样品接触。

在一些实施方案中，该方法包括获得包含多于一种核酸靶分子和一种或更多种不期望的核酸种类的第二样品，其中使封闭寡核苷酸与样品接触包括使封闭寡核苷酸与第二样品接触，并且其中使多于一种寡核苷酸探针与样品接触包括使多于一种寡核苷酸探针与第二样品接触，该方法包括在使多于一种寡核苷酸探针与样品接触之后，并且在延伸与多于一种核酸靶分子和一种或更多种不期望的核酸种类杂交的寡核苷酸之前：汇集样品和第二样品。在一些实施方案中，该方法包括汇集样品和第二样品，包括在将封闭寡核苷酸与样品和第二样品接触之前汇集样品和第二样品。封闭寡核苷酸可以在多于一种寡核苷酸探针与样品接触时与样品接触。在一些实施方案中，多于一种寡核苷酸探针中的至少一种包含封闭寡核苷酸。