[发明专利]经遗传修饰的禽及其重构方法

说明书

本文公开了转基因构建体、使用其的方法及通过此类方法提供的转基因禽，所述转基因构建体包含(i)第一核苷酸序列，其中由所述第一核苷酸序列编码的蛋白质的活性在外源诱导剂的存在下导致生殖细胞死亡，和(ii)第二核苷酸序列，所述第二核苷酸序列将所述构建体靶向禽生殖细胞。

技术领域

本发明涉及用于从生殖细胞产生经遗传修饰的和/或野生型禽(例如鸡)的方法、以及使用此类方法产生的禽。

背景技术

从分离的生殖细胞生产禽品种目前是一个在很大程度上效率低下且困难的方法。一个与经遗传修饰的禽的产生相关的具体问题是含有遗传修饰的生殖细胞稳定地传递到禽的后代和此类禽的后续世代中。特别地，当使用常规方法时，生殖细胞的传递效率特别低下，这是供体生殖细胞((可能经遗传修饰或可能未经遗传修饰))与内源性生殖细胞在形成功能性配子方面竞争的结果。

尽管二倍体生殖细胞可以从一种禽移植到宿主禽中，但是由后续形成的配子产生的后代的比例是可变的，一些或所有后代是由源自内源性((宿主鸟))生殖细胞的配子形成的(Nakamura等(2010)Reprod Fert Dev 22(8):1237-1246；Song等(2014)Biol Reprod 90(1):15)。内源性(宿主)生殖细胞可以使用辐射或化疗试剂(例如busulphan)破坏，但是这些毒性试剂也可以杀伤动物以及内源性生殖细胞。Tagami使用化学处理来产生无菌替代宿主鸡(Nakamura等(2010)Biol Reprod 83(1):130-7)。本发明人和Nakamura使用γ辐射杀伤内源性生殖细胞(MacDonald等(2010)Plos One5(11):e15518；Nakamura等,(2012)J Reprod Dev 58(4):432-437)。然而，尽管处理后由供体生殖细胞产生的后代数量增加，但是不是所有后代源自供体生殖细胞，并且该处理杀伤了许多宿主鸡。

已经制备了无菌哺乳动物和鱼转基因系，其在生殖细胞中表达基因产物(硝基还原酶，Ntr)，该基因产物在前药的存在下杀伤生殖细胞。iC9(诱导型caspase9)基因已用于杀伤人和小鼠的干细胞，并且用于杀伤转基因小鼠的内皮细胞。鉴于当应用于哺乳动物和禽时使用生殖细胞修饰技术获得的结果不同，预期此类技术不会直接转移到禽。例如，本发明人先前的工作已经通过基因编辑技术经由DDX4基因的遗传突变产生了不具有生殖细胞的雌性鸡。(Taylor等,Development 2017)。本发明人没有预期到雌性鸡是不育的，因为虽然具有突变型Ddx4基因的雄性哺乳动物是不育的，但是具有突变型Ddx4的雌性哺乳动物具有正常的生育力。因此，生殖细胞修饰技术对哺乳动物的影响可能与对禽的影响非常不同。不育还取决于发育期间内源性生殖细胞何时死亡。在禽中，DDX4不育雌性包含直至孵化的生殖细胞，该生殖细胞可以与注射到经基因修饰的宿主胚胎中的供体生殖细胞竞争。

发明内容

本发明解决了现有技术的许多问题。本发明人已经令人惊讶地表明，通过采用基因工程在生殖细胞中表达重组蛋白(其将根据需要选择性地杀伤宿主生殖细胞，例如在暴露于特定的前药或诱导剂时，而不杀伤宿主鸡中的其他细胞)可以实现供体生殖细胞的高效整合。来自不同禽物种的种质(生殖细胞)可以转移到该宿主禽，并且后代的遗传源自转移的材料(图1)

虽然已经制备了表达基因产物的无菌哺乳动物和鱼转基因系，但是禽和哺乳动物物种的蛋白质活性和功能的差异以及禽与哺乳动物物种之间的基因功能和活性的差异意味着，不能预期在哺乳动物和鱼中使用的技术可转移到禽，并且因此细胞修饰技术在禽中可能具有与在哺乳动物中非常不同的效果。不育还取决于发育期间内源性生殖细胞何时死亡(基因或蛋白质活性的时间性质)。必须在禽中测定许多不同的基因座，以确定它们是否在适当的发育阶段表达转基因，即生殖细胞在胚胎发育期间是否可以100％消融。