[发明专利]核酸的多重检测

权利要求书

1.一种用于确定样品中存在或不存在第一靶和第二靶的方法，所述方法包括：

(a)通过使假定包括所述第一靶和/或所述第二靶或其扩增子的所述样品或其衍生物与以下接触来制备反应混合物：

第一闭合茎-环寡核苷酸和第二闭合茎-环寡核苷酸，其中所述闭合茎-环寡核苷酸中的每个闭合茎-环寡核苷酸包括与未杂交核苷酸的闭合单链环部分连接的杂交核苷酸的双链茎部分，其中：

所述第一闭合茎-环寡核苷酸和所述第二闭合茎-环寡核苷酸的所述茎部分中的杂交核苷酸的数量和/或杂交核苷酸的序列不同，以及

酶，所述酶仅当与所述靶或其扩增子接触时才能够裂解或降解所述第一闭合茎-环寡核苷酸的和所述第二闭合茎-环寡核苷酸的所述单链环部分；

(b)处理所述反应混合物：

-在适合于所述酶诱导所述第一闭合茎-环寡核苷酸和所述第二闭合茎-环寡核苷酸的所述环部分的裂解或降解以由此产生第一开放茎-环寡核苷酸和第二开放茎-环寡核苷酸的条件下；

-在第一温度下，在所述第一温度下或高于所述第一温度，所述第一开放茎-环寡核苷酸的双链茎部分的链解离，以由此促进所述第一开放茎-环寡核苷酸的茎部分的荧光团分子和淬灭剂分子的空间分离并提供第一可检测荧光信号，以及

-在第二温度下，在所述第二温度下或高于所述第二温度，所述第二开放茎-环寡核苷酸的双链茎部分的链解离，以由此促进所述第二开放茎-环寡核苷酸的茎部分的荧光团分子和淬灭剂分子的空间分离并提供第二可检测荧光信号；

其中：

所述第一温度低于所述第二温度，并且

所述第一开放茎-环寡核苷酸的荧光团和所述第二开放茎-环寡核苷酸的荧光团在可见光谱的相同颜色区域中发射；以及

(c)在包括等于或高于所述第二温度的温度或由其组成的一种或多种温度下检测所述第一荧光信号和所述第二荧光信号的水平，以由此确定所述样品中存在或不存在所述靶。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述酶包括多组分核酸酶(MNA酶(MNAzyme))，并且对所述反应混合物的所述处理包括在适合于以下的条件下处理所述反应混合物：

第一多组分核酸酶(MNA酶)与所述第一靶或其扩增子结合并且所述第一MNA酶的底物臂与所述第一闭合茎-环寡核苷酸的所述环部分杂交，以由此促进所述第一MNA酶对所述第一闭合茎-环寡核苷酸的所述环部分的所述裂解，从而形成所述第一开放茎-环寡核苷酸。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述第一靶是能够与所述第一MNA酶的传感器臂杂交以由此促进所述第一MNA酶的组装的核酸序列或其扩增子。

4.根据权利要求1所述的方法，其中：

-所述第一靶是分析物、蛋白质、化合物或分子；

-所述酶包括具有适体的酶，所述适体能够与所述第一靶结合；并且

-所述第一靶与所述适体的结合能够使所述具有适体的酶呈现催化活性。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述具有适体的酶包括以下中的任何一个或多个：适体DNA酶(apta-DNAzyme)、适体核酶、适体MNA酶。

6.根据权利要求2、4或5中任一项所述的方法，其中：

-所述第一靶是分析物、蛋白质、化合物或分子；

-所述反应混合物进一步包括能够与所述第一MNA酶的传感器臂杂交以由此促进所述第一MNA酶的组装的寡核苷酸序列；

-所述第一MNA酶包括能够与所述第一靶结合的适体序列；并且

-所述靶与所述适体的结合能够使所述第一MNA酶呈现催化活性。

7.根据权利要求1到6中任一项所述的方法，其中在由所述酶进行所述裂解或降解期间，所述闭合茎-环寡核苷酸不与所述靶或其扩增子杂交。