[发明专利]用于检测和/或定量靶核苷酸序列的方法和试剂盒

说明书

本发明涉及一种用于检测和/或定量样品中靶核苷酸序列(3)的方法，所述方法包括以下步骤：提供单链形式的靶核苷酸序列(3)；将所述靶核苷酸序列(3)与单链核酸的第一探针(1)和与单链核酸的第二探针(2)杂交，所述第一探针(1)的一端固定在固体载体(4)上，并且另一端包含与所述靶核苷酸序列(3)的第一部分(5)互补的序列，所述第二探针(2)的一端被标记，并且另一端包含与所述靶核苷酸序列(3)的第二部分(6)互补的序列，其中所述靶核苷酸序列的第一部分(5)和第二部分(6)共有2至10个核苷酸，从而形成第一探针‑靶核苷酸序列‑第二探针复合体；并检测该复合体。本发明还涉及用于所述方法中的试剂盒。

相关申请的交叉引用

本专利申请要求于2018年8月9日提交的意大利专利申请号102018000008017的优先权，其全部公开内容通过引用纳入本文。

技术领域

本发明涉及基于具有两个核酸探针的系统用于检测和/或定量样品中靶核苷酸序列的方法和试剂盒。

背景技术

对不同生物样品(活检物(biospy)、血清、血浆、细胞培养物)中核酸的分析是许多疾病的研究和早期诊断(如阿尔茨海默氏病、癌症、骨关节炎、传染病)的基础，此外在兽医、农业和食品方面也有越来越多的应用。

分析的目的核酸为基因组DNA、信使RNA(mRNA)、核糖体RNA(rRNA)、转运RNA(tRNA)、不均一核RNA(hnRNA，前mRNA)和小序列RNA(小RNA)。将小RNA分裂为：微RNA(miRNA)、小核RNA(snRNA)、短干扰RNA(siRNA)、piwi相互作用RNA(piRNA)。

对于许多疾病的研究和早期诊断来说，微RNA是最令人关注的待分析的核酸。微RNA是具有18-24个核苷酸的短序列RNA(核糖核酸)，在转录和后转录水平上调节基因表达，通过抑制靶mRNA来与其结合。已经记载了不同物种(特别是哺乳动物)中的非常多的miRNA，通常序列的差异(因此效果的差异)是由于单个核苷酸的变化。它们的众多性和相似性需要开发能够在单个核苷酸水平上识别差异的高度特异性方法。微RNA有成为用于早期诊断许多疾病的新一代生物标记物的潜力。事实上，如今发现的许多新的生物标记物均为微RNA，它们参与调节许多生物系统和疾病，包括各种类型的癌症、神经退行性疾病和肌肉骨骼疾病(例如骨关节炎、阿尔茨海默氏病)。

迄今为止用于分析核酸的主要技术为PCR(聚合酶链反应)和直接测序。这些技术需要很长时间才能得到结果，需要高素质的人员来进行，而且非常昂贵。这些技术的另一个限制是它们容易被生物样品中存在的成分改变，例如Ca+、蛋白酶、核酸酶，和/或容易被用于收集和提取样品的缓冲液的质量和类型(例如EDTA、SDS的浓度)改变。因此，这些技术的另一个限制是在实际分析之前制备、提取和纯化样品，这容易延长时间和增加成本。具体而言，对于微RNA，如今使用的技术(PCR和测序)和正在销售的产品不令人满意，因为这些技术复杂，不易重复，不够特异性(没有针对短序列进行优化)，昂贵，需要较长时间和高素质的人员，并且与仪器和诊断-临床工作流程不兼容。

在EP2639312中已记载了一种避免使用PCR的方法。这种方法涉及使用具有DNA的寡核苷酸和能够识别DNA/RNA杂交体的抗体，但它仍然不允许以足够简单、可重复和灵敏的方式获得结果。

Hideyuki A.et al.,(2012),The Analyst,Vol.137,No.14,p.3234公开了一种用于检测miRNA的方法，所述方法包括与捕获探针和经标记的荧光探针的三明治杂交，其中两个探针完全相邻，以提供同轴堆叠效应。这种方法显示出有限的灵敏度。

因此，本发明的目的是提供用于检测和/或定量样品中的靶核苷酸序列的方法，所述方法以简单和有效的方式解决上述问题。具体而言，所述方法必须显示出高灵敏度、特异性、亲和力、稳定性、易于标准化、低成本和执行快速。

该目的是通过本发明实现的，因为该目的与权利要求1中限定的方法有关。