[发明专利]Hspa8基因的启动子

说明书

本发明提供了用于在宿主细胞、诸如源自哺乳动物的培养细胞中增强充当基于蛋白的药物产品的外源蛋白的产生的方法。本发明提供了具有新型Hspa8基因启动子的转染的细胞，以及使用所述转染的细胞以高水平分泌和产生外源蛋白的方法。

技术领域

本发明涉及通过使用具有Hspa8基因启动子的外源基因表达载体获得的具有增强的关于外源蛋白的转录活性的转染的哺乳动物细胞，以及使用其产生所述外源蛋白的方法。

背景技术

基因重组技术的发展已经迅速扩展基于蛋白的药物产品、诸如治疗性蛋白和抗体药物的市场。其中，抗体药物在施用于人体时不引起不良的免疫应答，并且由于其高特异性而正在积极开发。

产生以抗体药物为代表的基于蛋白的药物产品的宿主的实例可以包括微生物、酵母、昆虫、动物和植物细胞以及转基因动物和植物。翻译后修饰、诸如折叠或糖链修饰对于基于蛋白的药物产品的生理活性或抗原性至关重要。因此，不能进行复杂的翻译后修饰的微生物，或糖链结构与人显著不同的植物不适合作为宿主。培养的哺乳动物细胞、诸如CHO(中国仓鼠卵巢)细胞，由于其具有与人的糖链结构相似的糖链结构并且允许翻译后修饰，并且进一步考虑安全性，因此目前是主流。

与微生物等相比，将培养的哺乳动物细胞用作宿主呈现诸如低生长速率、低生产率和高成本的问题(非专利文献1)。此外，基于蛋白的药物产品的临床利用需要以大剂量施用药物产品。因此，其缺乏足够的生产能力已成为全球性问题。在培养的哺乳动物细胞表达系统中生产基于蛋白的药物产品的情况下，由于生产成本高于合成的低分子量药物产品的生产成本，因此试图通过对每个生产步骤进行改进来降低生产成本。然而，增加培养的哺乳动物细胞表达系统中产生的蛋白的量也是降低生产成本的有前途的方法(非专利文献2和3)。因此，为了增加培养的哺乳动物细胞中的外源基因的生产率，到目前为止，已经通过反复试验实践了许多方法，诸如启动子、增强子、药物选择标记、基因扩增和培养工程改造方法。在使用CHO细胞作为宿主细胞的情况下，源自病毒的人巨细胞病毒主要立即早期启动子(在下文中，称为CMV启动子)通常用于表达外源基因，即生产基于蛋白的药物产品(非专利文献4、5和6)。还已知在延伸因子-1α(EF-1α) (专利文献1和非专利文献7)或人核糖体蛋白RPL32或RPS11的基因的转录起始位点上游的多核苷酸(启动子区域)可以在CHO细胞中的蛋白表达中单独使用或与额外异源启动子组合使用(非专利文献8和专利文献2和3)。已知热休克蛋白A5 (Hspa5/GRP78)基因启动子在哺乳动物细胞中提高外源蛋白的生产率(专利文献4)。

引文列表

专利文献

专利文献1：日本专利号3051411

专利文献2：WO2006/123097

专利文献3：WO2013/080934

专利文献4：WO2018/066492

非专利文献

非专利文献1：Florian M. Wurm., Nat. Biotechnol. 22 (11): 1393-1398,2004

非专利文献2：Farid SS., J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci.848 (1): 8-18, 2007

非专利文献3：Werner RG. Economic aspects of commercial manufacture ofbiopharmaceuticals. J Biotechnol. 113 (1-3): 171-182, 2004

非专利文献4：Durocher Y等人, Curr Opin Biotechnol. 20 (6): 700-707,2009

非专利文献5：Boshart M等人, Cell. 41 (2): 521-530, 1985

非专利文献6：Foecking MK等人, Gene. 45 (1): 101-105, 1986