[发明专利]快速热循环方法

说明书

本发明公开了用于进行快速热循环的仪器、方法和试剂盒。

相关申请的交叉引用

本申请要求2018年6月7日提交的美国临时专利号62/681,830的权益和优先权，其全部内容通过引用并入本文。

背景技术

1.技术领域

本公开的实施方案总体上涉及用于扩增核酸的方法和装置。

2.背景技术

在美国、加拿大和西欧，传染病占人类死亡率的约7％，而在发展中地区，传染病占人类死亡率的40％以上。传染病导致各种临床表现。常见的明显表现包括发烧、肺炎、脑膜炎、腹泻和含血的腹泻。尽管物理表现表明了一些病原体并排除其他病原体作为病原因子，但仍存在多种潜在的致病因子，并且明确的诊断通常需要进行多种测定。用于诊断病原体的传统微生物学技术可能需要数天或数周，这通常会延迟正确的治疗过程。

近年来，聚合酶链式反应(PCR)已成为快速诊断传染因子的首选方法。PCR可以是诊断传染病的快速、灵敏且特异性的工具。使用PCR作为主要诊断手段的挑战是可能的致病生物体或病毒的多样性以及一些病理标本中存在的生物体或病毒的低水平。进行多组PCR测定，每组针对一种可能的致病生物体或病毒，通常是不切实际的，其中大多数预计是阴性的。当病原体核酸浓度低并且需要大量样品来收集足够的反应模板时，问题就更加严重。在一些情况下，并没有足够的样品用于测定所有可能的病原因子。一种解决方案是进行“多重PCR”，其中在单一反应中同时测定样品的多个靶标。尽管已经证明多重PCR在一些系统中是有价值的，但是存在关于高水平多重反应的稳健性和难以清楚分析多种产物的缺点。为了解决这些问题，可以随后将测定分成多重二级PCR。在初级产物中嵌套二级反应提高了稳健性。在初级产物中嵌套二次反应提高稳健性。诸如(BioFire Diagnostics，LLC，盐湖城，犹他州)的密闭系统减少了处理，由此降低了污染风险。

PCR从概念上可以分为3个反应，每个反应通常假定在三个温度中的每个温度下随着时间推移而发生。就每个循环3个时间段的3个温度下发生的三个反应(变性、退火和延伸)而言，PCR的这种“平衡范式”很容易理解。但是，这种平衡范式并不能很好地符合物理现实。瞬时温度变化不会发生；改变样品温度需要花费时间，并且整个样品的温度可能不均匀，特别是在使用大体积样品的情况下。此外，各个反应速率会随温度而变化，并且一旦发生引物退火，聚合酶延伸紧随其后。更准确地，特别是对于其中反应速率和温度始终在变化的动力学范式的快速PCR。只要产物变性和引物退火，在PCR期间保持温度恒定是不必要的。在PCR的动力学范式下，产物变性、引物退火和聚合酶延伸可能会暂时重叠，并且它们的速率会随着温度而不断变化。在平衡范式下，循环由3个温度来限定，每个均保持一段时间，而动力学范式则需要转换速率和靶标温度。图5a-图5b示出了平衡范式和动力学范式的说明性时间/温度曲线。但是，应当理解，这些温度曲线仅是说明性的，并且在PCR的一些实施方式中，将退火和延伸步骤组合，从而使得仅需要两个温度。

当PCR在20世纪80年代后期首次普及时，其过程缓慢。一个典型的方案是94℃变性1分钟，55℃退火2分钟，72℃延伸3分钟。当包括用于温度之间转换的时间时，典型的是8分钟，这使得在4小时内完成30个循环。25％的循环时间花费在温度转换。随着循环速度的增加，在温度转换上花费的时间比例也增加，并且动力学范式变得越来越相关。在快速循环PCR期间，温度通常是变化的。对于短产物(100bps)的快速循环PCR，100％的时间花费在温度转换，并且没有保持时间是必要的。对于较长产物的快速循环PCR，可以包括在最佳延伸温度处保持的温度。