[发明专利]一种制备重组人凝血因子Ⅷ的方法

说明书

一种制备重组人凝血因子Ⅷ的方法，包括利用波浪式生物反应器培养表达重组人凝血因子Ⅷ的人胚肾细胞293/N27‑7以及从细胞培养液中分离并纯化重组人凝血Ⅷ因子。波浪生物反应器混合效率高，气液交换充分，泡沫少且剪切力低，避免了搅拌式不锈钢反应器浆叶端和气泡对细胞的伤害。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种制备重组人凝血因子VIII的方法，具体涉及利用筛选的人胚肾细胞，通过波浪式生物反应器培养表达重组人凝血因子VIII的细胞以及从细胞培养液中分离并纯化重组人凝血VIII因子。

背景技术

血友病为一种先天性凝血因子基因缺陷或突变导致凝血功能障碍的遗传出血性疾病。根据相应的凝血因子将血友病分为甲型、乙型、丙型血友病(即血友病A、B、C)，其中血友病A占80％-85％。目前替代疗法如输注血浆、凝血因子VIII或IX是治疗血友病有效措施，但由于血浆来源的凝血制品极易造成血源性病毒污染，基因重组类凝血因子因其安全性及有效性成为治疗血友病的主要产品。重组人凝血因子VIII与天然凝血因子VIII具有相似的生化、免疫及药理学特性，能有效纠正血友病患者的出血倾向，具有良好的治疗效果。目前上市的重组人凝血因子VIII有Recombinate(Baxter公司)、Advate(Baxter公司)、KogenateFS(Bayer公司)、ReFacto(pfizer公司)、Xyntha(pfizer公司)、Eloctate(Biogen公司，B结构域缺失的因子VIII与IgG1Fc结构域的融合蛋白)以及Octanate(Octapharma公司)等。

作为哺乳动物表达细胞的一种，人胚肾细胞(HEK293)表达系统已经被用于制备许多包含重组凝血八因子的治疗蛋白，其表达的重组蛋白的蛋白翻译后修饰完全且免疫反应低，但常用的HEK293细胞培养工艺技术壁垒高，细胞结团严重，细胞状态难以维持。此外，目前重组八因子的细胞株的规模化培养主要采用的是传统搅拌式反应器，如中国专利申请CN103517919采用搅拌式反应器通过施加较大的剪切应力(即较大的搅拌速率)悬浮培养HEK293细胞，培养产生的重组人凝血八因子最高活性仅达到16IU/ml；中国专利申请CN102776260通过在培养过程中控制细胞培养液中血管性血友病因子与人凝血八因子的活性比为1-10∶1，获得的重组人凝血八因子的表达量最高也仅达到10-20国际单位/天/10⁶细胞。因此，仍需要高效培养重组人凝血因子VIII的方法。

WAVE波浪生物反应器混合效率高，气液交换充分，泡沫少且剪切力低，避免了搅拌式不锈钢反应器浆叶端和气泡对细胞的伤害，因此细胞状态、细胞活率及蛋白活性均高于搅拌式不锈钢反应器。CN107287265公开了制备重组人凝血因子VIII的方法，通过波浪式生物反应器培养表达重组人凝血因子VIII的细胞以及从细胞培养液中分离并纯化重组人凝血VIII因子。

发明内容

本发明一方面提供一种制备重组人凝血因子VIII的方法，包括：

(1)采用波浪式生物反应器培养表达重组人凝血因子VIII的细胞，所述细胞处于对数生长期且细胞状态良好，所述反应器培养的温度为36.5℃，转速16-18rpm，角度6-8度，CO₂浓度6-10％，空气3-5lpm，0-48±3小时溶解氧(DO)设定为40％、48±3至66±3小时DO设定为25％、66±3小时至培养结束DO设定为40％，培养时间为66-96小时，培养方式为流加培养；

(2)从步骤(1)的细胞培养液中收获重组人凝血因子VIII。

在一些方案中，所述重组人凝血因子VIII选自全长的重组人凝血因子VIII，或者B结构域缺失的重组人凝血因子VIII(BDDrFVIII，其序列可参见专利文献CN107287265A的SEQ ID NO：1)。在本发明的一个优选实施方案中，所述重组人凝血因子VIII选自B结构域缺失的重组人凝血因子VIII。

在一些方案中，步骤(1)的细胞为经筛选的表达重组人凝血因子VIII的人胚肾细胞293(HEK293)。