[发明专利]在无细胞体系中对DNA进行编辑的方法

权利要求书

1.一种在无细胞体系中对DNA进行编辑的方法，包括以下的工序：

(1)在无细胞体系中，在DNA的目标部位导入缺失、替换或添加的工序；以及

(2)将在工序(1)中导入了缺失、替换或添加的DNA在无细胞体系中扩增的工序，其中，该DNA在以20℃～80℃范围的温度温育的温度条件下扩增。

2.根据权利要求1所述的在无细胞体系中对DNA进行编辑的方法，包括以下的工序：

(1)在无细胞体系中，在DNA的目标部位导入缺失、替换或添加的工序；以及

(2)将在工序(1)中导入了缺失、替换或添加的DNA在无细胞体系中扩增的工序，其中，该DNA在等温温育、或者在以2个65℃以下的温度反复温育的温度循环下温育的温度条件下扩增。

3.根据权利要求1或2所述的在无细胞体系中对DNA进行编辑的方法，包括以下的工序：

(1)在无细胞体系中，在DNA的目标部位导入缺失、替换或添加的工序；以及

(2)将在工序(1)中导入了缺失、替换或添加的DNA在无细胞体系中扩增的工序，其中，该DNA在处于20℃～80℃范围内的一定的温度温育、或者在以2个65℃以下的温度反复温育的温度循环下温育的温度条件下扩增。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，在特异性切割未导入缺失、替换或添加的DNA的人工DNA切割酶的存在下进行工序(2)。

5.根据权利要求4所述的方法，人工DNA切割酶为人工核酸酶或RNA引导性核酸酶。

6.根据权利要求4所述的方法，人工DNA切割酶为CRISPR-Cas9。

7.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，DNA为环状DNA。

8.根据权利要求7所述的方法，工序(2)包括以下的工序：

(2-1)制备含有(a)催化环状DNA的复制的第一酶群、(b)催化冈崎片段连接反应来合成形成环连体的2个姊妹环状DNA的第二酶群和(c)催化2个姊妹环状DNA的分离反应的第三酶群的反应溶液与在工序(1)中导入了缺失、替换或添加的环状DNA的反应混合物的工序；以及

(2-2)将工序(2-1)中制备的反应混合物在处于20℃～80℃范围内的一定的温度下温育、或者在以2个65℃以下的温度反复温育的温度循环下温育的工序。

9.根据权利要求8所述的方法，环状DNA包含能够与具有DnaA活性的酶结合的复制起始序列。

10.根据权利要求7所述的方法，工序(2)中，环状DNA是通过滚环扩增而扩增的。

11.根据权利要求1～10中任一项所述的方法，工序(1)包括以下的工序：

(1-1)使人工DNA切割酶作用于DNA从而在目标部位对该DNA进行切割，制备至少一条直链DNA的工序；

(1-2)制备含有工序(1-1)中制备的直链DNA、1种以上DNA片段和具有RecA家族重组酶活性的蛋白的反应溶液的工序；以及

(1-3)使该直链DNA与该1种以上DNA片段在碱基序列相同的区域彼此或碱基序列互补的区域彼此互相连接，形成在模板DNA的目标部位插入有该1种以上DNA片段的DNA的工序。

12.根据权利要求1～10中任一项所述的方法，工序(1)包括以下的工序：

在用于导入缺失、替换或添加的单链DNA存在下进行DNA的复制反应的工序，其中，该单链DNA能够在复制反应的条件下与该DNA的目标部位杂交。

13.根据权利要求1～12中任一项所述的方法，工序(2)中，DNA在重复30℃以上的温育和27℃以下的温育的温度循环下进行温育的温度条件下扩增。

14.根据权利要求1～13中任一项所述的方法，导入缺失、替换或添加的DNA的大小为50kb以上。