[发明专利]FX活化方法及其在FXa组合物制备中的用途

说明书

本发明涉及高纯度凝血因子Xa(FXa或活化凝血因子X)的制备以及用于获得所述高纯度和高活化度的FXa的活化和纯化方法，其无需在制备过程中添加蛋白质活化剂。

技术领域

本发明涉及高纯度凝血因子Xa(FXa或活化凝血因子X)的制备以及用于获得所述高纯度和高活化程度的FXa的活化和纯化方法，其无需在生产过程中添加蛋白质活化剂。

背景技术

凝血因子Xa(FXa)是在整个凝血过程中通过其维生素K依赖性酶原凝血因子X(FX)的活化而生成的双链糖蛋白。体内FXa可以通过外部途径(即通过因子VIIa活化)或通过内在途径(即通过活化的凝血因子IX(FIXa)和VIII(FVIIIa))活化而产生。该分子经历Arg15-Ile16键的酶促断开，释放出52个氨基酸的活化肽。在存在其辅因子、凝血因子Va(FVa)、钙(Ca)离子和带负电荷的磷脂膜的情况下，FXa与它们结合在一起形成凝血酶原(FII)活化复合物(Toso等人2008)。

除了这些天然活化途径外，还有几种利用胰蛋白酶(Bajaj等，1973)或非人类活化剂的体外方法，其中所述非人类活化剂来源于山蝰毒液(Fujikawa等，1974)或真菌(Rüchel等，1983)、细菌(Imamura等，1997)或植物(Richter等，2002)。WO 2008/145989A1教导了两种技术，其通过将毒液、特别是山蝰毒液作为FX活化剂与钙离子联合起来使用以将FX活化为FXa。山蝰毒液含有物质RVV-V和RVV-X，它们直接激活因子V和FX。RVV-X是Zn2+依赖性丝氨酸蛋白酶。在第一种技术中，在含有25mM氯化钙和0.01U/ml(RVV-X)的溶液中温育FX。相比之下，在第二种技术中，RVV-X被固定在活化的上并与FX接触。随后除去树脂，而FXa保留在上清液中。结果，添加源于蛇的活化剂需要有效的方法以从FXa制剂中去除潜在的可浸出物(毒液)，特别是如果打算用于人类的话。尚亟需其他分离技术，以使对成品的安全性和耐受性的担心降至最低。

WO 2016/025601A1描述了一种FX活化方法，该方法不依赖毒液活化剂，而是利用与AEX树脂结合的FX的自活化(auto-activation)，其中结合的FX与含钙离子的溶液接触数小时，然后被从树脂上洗脱下来。从AEX树脂洗脱的FXa的产率约为共洗脱FX的5％，这是生产工艺的不足之处。

因此，使用合成制备的药品级质量的活化剂得到高度重复性的转化率的活化方法将是该领域的重大突破。

FXa是在靠近凝血级联末端处生理地产生的，其表现为一种对于将凝血酶原(FII)转化为凝血酶(FIIa)所必须的蛋白酶，并因此该蛋白酶对于纤维蛋白原转化为纤维蛋白也是必须的，其作用在于伤口闭合及止血：在级联反应中位于FVIII下游，因而FXa原则上也可以在不存在FVIII或FVIII被抑制的情况下驱动凝血，因此可以认为具有“因子八旁路活性(factor eight bypassing activity)”。

基于其因子八旁路活性，FXa可以用于治疗A型血友病患者。血友病A是一种x染色体连环遗传性疾病，其由于凝血因子VIII的缺乏或功能异常而导致严重的出血。在血友病患者的治疗中，中和性同种抗体的进行性发展屡有报告(Kempton 2009)。这种高滴度抑制剂患者不能用凝血因子VIII(FVIII)替代来有效地治疗，原因在于所施加的FVIII被这些抑制剂中和了。患者会经受出血事件，可以使用活化的凝血酶原复合物浓缩物(aPCC)进行治疗(Kempton 2009)。aPCC包括凝血因子(部分被活化)和其他血浆蛋白的复杂混合物(complex mixture)。另一种治疗方法是应用重组产生的活化凝血因子(rFVIIa)。rFVIIa能够直接将血小板表面的FX活化(Kempton 2009)。通过通常与免疫调节物质和/或旁路产品(by-passing product)进行组合来施加FVIII，可以在70％的接受常规和长期治疗的患者中实现免疫耐受诱导(ITI)(Kempton 2009)。