[发明专利]用于纯化包膜病毒的方法

说明书

本发明涉及用于纯化包膜病毒的方法。本发明进一步涉及可通过所述方法获得的一种包膜病毒或多种包膜病毒。

技术领域

本发明涉及用于纯化包膜病毒的方法。本发明进一步涉及可通过所述方法获得的一种包膜病毒或多种包膜病毒。

背景技术

现今，除单克隆抗体之外，基于病毒颗粒的新型生物制药产品有广阔的前景。这些病毒颗粒可应用于基因疗法或免疫接种。广谱的应用(特别是在癌症或感染性疾病的治疗或预防中)结合不断扩大的医疗市场，正在推动着基因治疗载体和病毒疫苗的生产工艺的改进。

使用良好表征的动物细胞系和可扩展的生产系统使得大大改善天然和重组病毒的滴度和产品质量。然而，对病毒颗粒的下游纯化工艺的投入却少得多。

通常必须通过纯化工艺去除与工艺相关的污染物(例如牛血清白蛋白、可提取物、核酸酶、可浸出物)或与产品相关的污染物(例如宿主细胞蛋白、宿主细胞DNA、蛋白聚糖和糖胺聚糖)。随着上游滴度不断提高，病毒的下游加工(DSP)成为关键瓶颈。除了颗粒尺寸和异质性、等电点(pI)和表面疏水性以外，病毒的不稳定性在活病毒纯化工艺的设计中也扮演着重要的角色。对于包膜病毒尤其如此，因为病毒包膜的物理化学性质对经济高效的工业病毒生产提出了挑战。

许多DNA病毒和RNA病毒具有病毒包膜。脂质双层包膜覆盖其蛋白衣壳，衍生自宿主细胞膜的一部分，其中包含病毒糖蛋白。为了逃避免疫系统，病毒可在短时间内改变表面蛋白。而且，这些病毒的包膜对热、洗涤剂和干燥相对敏感，这导致包膜病毒在宿主环境外的存活有限。包膜病毒比非包膜病毒更容易变性，通常必须直接在宿主之间转移/被转移。

包膜病毒仍然用作减毒活疫苗。与灭活的病毒粒子或纯化的亚单位相比，其诱导更为广泛的免疫应答。

一些包膜病毒甚至被用作载体疫苗，例如痘病毒(pox viruses)、甲病毒(alphaviruses)、黄病毒(flaviviruses)、副粘病毒(paramyxoviruxes)和疱疹病毒(herpes viruses)。在这种情况下，包膜病毒用于携带另一种病毒的抗原或肿瘤抗原，用于在接受者中表达。用作基因疗法载体的其它包膜病毒包括逆转录病毒、痘病毒和疱疹病毒。

显然，挑战在于活包膜病毒的温和下游处理(DSP)以维持病毒感染性(这是至关重要的)，例如，用于基因疗法应用、病毒载体疫苗或溶瘤病毒。

本领域中用于纯化包膜病毒的相应方法通常在其大规模转移能力上受到限制，与大量收率损失有关或者不能满足用连续细胞系生产的药物产品所需的纯度水平。

在包括原代鸡胚成纤维细胞(CEF)在内的原代细胞的有限培养物中产生了大量基于病毒的疫苗。由于来源于原代细胞的疫苗的广泛经验及其有限的寿命，在原代CEF细胞上生产的疫苗通常被认为是节约的，并且对于宿主细胞DNA或宿主细胞蛋白的应用水平要求较不严格。然而，由于必须从有胚卵中产生CEF细胞，因此即使在无特定病原体(SPF)的农场中，其仍具有污染感染源的潜在风险。每个生产的疫苗批次的制造成本高昂和生物安全性测试昂贵促使该行业倾向于连续细胞系。可库存永生细胞，在细胞库水平上对其进行表征，并用于生产多个疫苗批次，而这种生产对于单个批次需要较少的广泛测试。而且，连续细胞系允许掺入辅助基因以支持减毒活病毒和存活但复制无能的病毒载体。

此类载体的一个实例为改良安卡拉痘苗(MVA)病毒，一种高度减毒的痘苗病毒，不能在人细胞中复制，其用作重要疫苗载体以携带无关病毒的抗原或特定肿瘤抗原。痘苗是最大的DNA病毒。另一实例为新城疫(ND)病毒，一种禽副粘病毒，已经显示出在人肿瘤中复制的潜力，并且可作为溶瘤剂以杀死肿瘤细胞并产生有效的抗肿瘤免疫应答。在过去，两种病毒都已在CEF细胞上繁殖。