[发明专利]用于改进小体积样品的免疫测定灵敏度和动力学的依次采样方法

说明书

本公开提供了一种用于增强检测生物样品中存在的分析物的方法。在形成分析物/特异性结合成员/可检测标记物复合物之后，洗脱标记物并使洗脱液的第一等分试样与固体支持物接触，其中所述固体支持物包含固定至所述固体支持物的特异性结合所述标记物的特异性结合成员，从固体支持物除去第一等分试样，并使固体支持物与洗脱的标记物的第二等分试样接触，并重复上述步骤，使得标记物在固体支持物上浓缩，用于进一步分析以定量生物样品中的分析物。

相关申请的交叉引用

本申请要求2018年5月4日提交的美国临时专利申请号62/667,238的优先权，所述美国临时专利申请的公开内容通过引用并入本文。

电子提交的材料通过引用并入

通过引用以其整体并入本文的是与此同时提交并标识如下的计算机可读核苷酸/氨基酸序列表：于2019年5月3日创建的名为“36422-WO-1-ORD_ST25”的一个726字节ASCII (文本)文件。

发明背景

可以准确地分析样品中的目标分析物的方法和装置对于诊断、预测、环境评价、食品安全、化学或生物战剂的检测等是必要的。此类方法和装置需要准确、精确和敏感。如果非常小的样品体积可以用最少的仪器快速分析也是有利的。尽管较新的检测技术(诸如单分子计数)可以检测样品中的非常少量的分析物，但由于上样和采样错误，此类方法经常产生可变的结果。因此，需要具有小体积的改进的样品分析能力的方法和装置。

发明简述

本公开提供了用于检测生物样品中存在的分析物的方法。所述方法包括：(a)提供一定体积的怀疑含有分析物的生物样品；(b)使固体支持物与所述体积的生物样品的第一等分试样接触，其中所述固体支持物包含固定至所述固体支持物的特异性结合所述分析物的第一特异性结合成员；(c)使所述固体支持物/第一特异性结合成员/分析物复合物与第二特异性结合成员接触，所述第二特异性结合成员特异性结合所述分析物并包含与所述第二特异性结合成员附接的可分离的可检测标记物，其中形成固体支持物/第一特异性结合成员/分析物/第二特异性结合成员复合物；(d)从与所述固体支持物结合的复合物分离和洗脱所述可检测标记物；(e)将可检测标记物的等分试样转移至第二固体支持物，所述第二固体支持物包含特异性结合所述可检测标记物的第三特异性结合成员；(f)从所述固体支持物除去第一等分试样，并使所述固体支持物与洗脱的可检测标记物的第二等分试样接触；(g)将步骤(e)和(f)重复5至30次，其中形成固体支持物/第三特异性结合成员/可检测标记物复合物；(h)除去任何未与所述固体支持物结合的可检测标记物；和(g)通过评价由所述可检测标记物产生的信号来定量所述分析物。

附图简述

图1A是一系列原始TIRF图像，其显示实施例1中描述的单分子计数灵敏度模型的结果。图1B是举例说明用SM-TIRF和峰发现算法测量的荧光峰/帧的中值数的图。图1B的插图是低浓度范围的扩展。误差条代表三次独立实验间的标准偏差。

图2是举例说明实施例2中描述的用SM检测的微粒测定的结果的图。该图绘制峰/帧的数目相比于初始的未浓缩的“分析物”浓度，而插图显示低浓度范围(误差条：标准偏差，n = 3)。

图3A是举例说明通过泵送空气从固体支持物除去等分试样的程序的图。图3B是举例说明使用实施例3中所述的重复采样方法的分析物浓度的结果的图。初始背景样品显示在添加任何缀合物之前的测量结果，而第二饱和样品经历与缀合物的60分钟孵育。剩余的样品是从已经上样和再上样至同一孔中的来自一种储备溶液的一系列等分试样。每个孵育期为2分钟，并且在每次测量之前将孔洗涤。所有样品间的背景水平显白色，并且右轴显示重新归零的峰计数。

图4A是举例说明对于具有在初始、第10次、第30次和第50次再上样之后采集的SM-TIRF测量值的每份样品从实施例3中描述的相应储备物再上样的样品的结果的图。图4B是这样的图，其针对储备物浓度绘制图4A中的数据，以表明样品之间的相对关系在整个再上样浓缩程序中得以维持。误差条展示给定样本测量内的40次图像采集的标准偏差。