[发明专利]用于测序数据的归一化和定量的方法

权利要求书

1.一种用于测序测定的读数值归一化的方法，其包括：

提供包含待测序的一种或多种未知核酸的样品；

向样品中添加已知数量的内部定量标准品；

制备用于测序的包含内部定量标准品的样品，其中所述制备包括将测序特异性衔接子位点和样品特异性鉴定序列引入样品中的未知核酸和内部定量标准品内；

测序以生成样品的测序数据集，其中所述测序数据集包括从未知核酸和内部定量标准品观察到的测序读数；

计数测序数据集中源于未知核酸和内部定量标准品的测序读取数；和

对测序数据集进行归一化，其中所述归一化（1）基于关于样品的内部定量标准品的测序读数的最小数目的存在，将数据接受/拒绝标准应用于测序数据集，并且（2）确保将基本上相同的检测限（LOD）应用于测序测定中的所有未知核酸。

2.权利要求1的方法，其中所述样品中的每种未知核酸具有约10²-10⁷个拷贝/ml的浓度。

3.权利要求1的方法，其中加入所述样品中的内部定量标准品的已知数量在约10⁴-10⁶个拷贝/ml的范围内。

4.权利要求1的方法，其中对所述测序数据集进行归一化保留NORM测序读数，其中NORM= 测序读取数*（F/观察到的源于内部定量标准品的测序读取数），并且其中‘F’是固定的内部定量标准品测序读数的最小预计数目。

5.权利要求4的方法，其中未知核酸读数和内部定量标准品读数各自通过相同比率ALPHA分别进行归一化，其中ALPHA = F/观察到的源于内部定量标准品的测序读取数。

6.权利要求1的方法，其进一步包括在归一化之后，计算样品中的未知核酸的输入数量（IQT），其中由于内部定量标准品的输入数量是已知的，因此可以通过IQT = 归于未知核酸的归一化的未知核酸测序读取数*（内部定量标准品的输入数量/F），来计算未知核酸的输入数量（IQT）。

7.权利要求1的方法，其中制备样品包括样品裂解，从裂解产物中回收核酸，并且任选地纯化回收的核酸，并且将引物结合位点和样品特异性鉴定序列引入待测序核酸的区域内。

8.权利要求7的方法，其中所述附接包括以下之一：

使用具有双重索引测序突出端的靶特异性引物，在扩增反应中扩增待测序的核酸，所述靶特异性引物包含测序引物结合位点和样品特异性鉴定序列，或

使待测序的核酸片段化，并且连接至片段化的核酸测序特异性衔接子，所述衔接子包含测序引物结合位点和样品特异性鉴定序列。

9.权利要求8的方法，其中扩增待测序的核酸包括：

使用具有定制突出端的靶特异性引物执行第一多重PCR反应，

执行第一次核酸纯化，

使用双重索引测序衔接子引物执行第二PCR反应，所述引物对第一PCR中引入的突出端退火或连接，其中所述双重索引测序衔接子引物是靶不依赖性的，并且包含测序引物结合位点和样品特异性鉴定序列，

执行第二次核酸纯化。

10.权利要求1的方法，其进一步包括合并两个或更多个样品，并且使其同时经受测序，其中所述两个或更多个样品在制备之后和在测序之前进行合并。

11.权利要求1的方法，其中所述测序测定是下一代测序测定。

12.权利要求1的方法，其中所述测序测定并不包括执行相对定量，在与所述测序测定分开的反应中执行定量，使用测定或模板特异性定量标准品，或使用竞争性模板作为定量标准品。