[发明专利]用于解析核酸混合物和混合细胞群体的方法和试剂及相关应用

说明书

本文公开了用于评估和解析核酸混合物和/或混合细胞群体的方法和相关试剂。本技术的一些实施例涉及利用双重测序来评估和解析样品中的核酸混合物(例如，多嵌合体混合物、来自多于一个来源的核酸的混合物等)和相关应用。其他实施例涉及检测和定量来自混合物的核酸的供体来源。

相关申请的交叉引用

本申请要求2018年5月16日提交的美国临时专利申请第62/672,573号和2019年2月27日提交的美国临时专利申请第62/811,517号的优先权和权益，它们的公开通过引用以其整体并入本文。

背景技术

解析来自不同克隆或个体的混合细胞群体，或追踪核酸混合物中的原始来源，通常需要追踪在对混合物有贡献的克隆或个体之间不同的特异性遗传标记物。虽然有时可以通过非遗传手段(即在细胞表面上表达的蛋白质的差异等)区分来自不同克隆或个体的细胞，但这并不总是可能的，或者对于高通量使用在实验上可能是不切实际的。遗传多态性可以用作一种方便的、可预测的和统计上可推广的谱系标记物，用于定义细胞或DNA分子的来源。例如，在人类中，约0.1％的人类基因组是多态性的(例如，在人类群体中，每1000个核苷酸碱基中有一个在序列上不同)。常见的变异形式可以包含单核苷酸多态性/单核苷酸变体(SNP/SNV)、多核苷酸变异(MNV)、短插入和缺失(indel)、短串联重复序列(STR)长度的变异以及其他更大规模的结构变异，诸如染色体间或染色体内重排、复制、缺失、串联复制和倒位等。

一般而言，当对个体进行基因分型时，可以通过解析基因型中的这些多态性差异来区分每个个体的各自身份。当使用短读下一代DNA测序(NGS)平台用于基因分型时，SNP是用于区分不同个体的最丰富和最方便的多态性形式之一。给定的多态性位点的总体群体变异程度通常由次要等位基因频率(MAF)来描述，次要等位基因频率是群体中第二个最常见变体的频率(即如从记录的变异(诸如dbSNP)的数据库中确定)。作为示例，0.5的MAF通常意味着在群体中每个等位基因存在50％的丰度，并且0.05的MAF通常意味着存在一个等位基因的5％的丰度和另一个等位基因的95％的丰度，尽管也可以存在较低频率的等位基因(即一个变体为5％，另一个为92％和第三个为3％)。通常，被查询的多态性位点越多，两个或更多个体就越可能彼此区分(图1)。因为基因组的相邻部分通常是共遗传的(即，在连锁不平衡中)，所以评估基因组的不同区域中(即，在不同的染色体上)的多个多态性位点对于最大化能够有效地区分来自不同个体的细胞混合群体的两个或更多个个体贡献者的机会通常是有利的。

已经解析和定量来自不同个体的细胞的混合物的一种方法是单细胞分析方法(图2)，其中对个体细胞进行基因分型(对来自每个独立细胞的DNA或RNA进行测序，并且对每个独特的基因型进行计数)。这可以通过在单个试管、板孔、液滴等中将每个细胞处理为不同的实体来实现，使得来自每个细胞的衍生序列读数可以连接回该相同的细胞(通常使用某种形式的单细胞条形码技术，即，PMID 28091601、PMID 2954551、PMID 30087104)。这种方法是有利的，因为来自单个细胞或大DNA分子的许多多态性标记物的基因型可以在信息上连接在一起，然而，这些方法通常是复杂的、昂贵的并且经常需要完整的细胞或其他特殊的材料制备。

另一种方法是单分子分析，其中混合和生长在一起的细胞具有大量提取和基因分型的核酸，并且计数单个多态性位点的相对丰度。结果可以在计算上去卷积，并且与来自每个单独来源的已知基因型进行比较(图3)。在细胞内不含的DNA分子的混合物可以类似地进行基因分型和去卷积。这种方法比单细胞基因分型更简单，但可能需要测序至更高的深度并评估更多的多态性位点，以从技术上解析混合物。这种方法还可能需要高得多的测序准确度，这对于常规的NGS方法来说可能是限制性的，尤其是当混合物的复杂性增加时。

发明内容