[发明专利]用于制造DNA测序阵列的方法和系统

说明书

本公开内容涉及在原位合成阵列中反转寡核苷酸探针的方法。这些方法可用于逆转探针相对于基底的朝向从与一种基底3’结合到与另一种基底5’结合。这些方法也可用于减少或消除原位合成阵列中截短的探针序列的存在。这些方法可以在反转后保留合成寡核苷酸的最初图案。这些方法可以通过形成水凝胶层的聚合反应在供体基底和受体基底之间形成水凝胶层来实现。

交叉引用

本申请要求于2018年3月21日提交的美国临时专利申请号62/646,279的权益，该临时申请通过引用以其全文并入本文。

背景技术

高密度DNA微阵列已被广泛应用于一系列基因组序列分析，包括突变和多态性(SNP基因分型)、细胞遗传学(拷贝数)、核蛋白质组学、基因表达谱的检测和分析和转录组分析。尽管许多此类应用可以采用基于直接杂交的方法进行读出，但是酶促读出的使用可能会提供某些明显的优势。例如，与仅通过杂交检测相比，聚合酶延伸或阵列序列的连接可能提供更高水平的区分。

一种用于制造超高密度DNA微阵列的方法将原位合成与光刻半导体制造方法相结合，以在基底上提供具有高密度DNA序列的阵列。光刻方法可产生不完整或截短的探针序列的群体，这伴随着合成完整的期望或预期长度的探针序列(“全长”探针)。此类截短的探针序列的存在会对阵列性能产生不利影响，例如，在杂交反应中导致不良的信噪比。然而，光刻方法允许在3’至5’方向进行有效的寡核苷酸合成，合成探针的3’末端与固体支持体结合(5’向上的微阵列)。在某些要求对游离探针末端进行酶促寻址的酶促反应中，如在聚合酶延伸反应或连接反应中，需要游离的3’-羟基来进行酶促反应。通过光刻方法合成的序列的朝向通常为3’→5’方向。这使合成序列的3’末端附接在表面，无法参与需要游离的3’-羟基末端的酶促反应。

相反，固定在微珠阵列(例如，Illumina)和其他点样阵列上的寡核苷酸探针通常通过胺或其他官能团附接至其基底，所述胺或其他官能团合成地附接至先前已合成并纯化的全长探针的5’末端。但是，以这种方式难以合成复杂度增加的阵列。迄今为止，3’向上的微阵列几乎完全是通过“自上而下”的微制造策略分两个步骤制造的：首先按照常规方式以5’向上的朝向合成分子，合成序列的5’末端带有一个接头。然后将合成序列从其3’末端切割下来，随后使5’末端连接全体与基底反应，并通过点样产生3’向上的序列。

发明内容

期望将探针在原位合成阵列(如用光刻法制造的阵列)上的朝向反转，以使探针在5’→3’方向上带有游离的3’-羟基末端，并且处于“全长”。本公开内容提供了用于完成探针序列的朝向的分子反转的方法，使得最初在供体基底上从3’末端合成的探针序列被转化为通过它们的5’末端附接至受体基底上的探针序列，以暴露游离的3’-羟基，同时在所得受体基底上保持供体基底上序列的最初图案。另外，本公开内容还可以减少或消除受体基底中的截短的寡核苷酸探针。

目前用于制造高分辨率光刻DNA微阵列的技术可能会受到以下限制：每个序列的3’末端均锚定在硬质基底上，并且因此无法进行许多潜在的酶促反应。本公开内容提供了可以将整个微阵列反转至水凝胶中的技术。该方法可以保留微阵列最初图案的空间保真度，同时去除所有其他微阵列制造策略固有的错误合成的低聚物。首先，可合成供体晶片上的标准5’向上的微阵列，其中每个寡核苷酸均在附接至微阵列表面的寡核苷酸的3’末端处通过可切割的接头锚定，并在5’末端具有丙烯酸亚磷酰胺(以下称为“Acrydite”)。

Acrydite或丙烯酸亚磷酰胺是一种亚磷酰胺，它可以合成在5’末端具有甲基丙烯酸基团的寡核苷酸，即7-甲基丙烯酰胺基庚基膦酸，在寡核苷酸的5’末端的单酯：