[发明专利]来自十二指肠布鲁纳氏腺的干/祖细胞及其分离和使用方法

说明书

本文公开的是具有内胚层干细胞表型特征且多能性标志物呈阳性的布鲁纳氏腺干/祖细胞(BGSC)，以及从人十二指肠分离它们的方法。此外，本公开提供了从人供体的十二指肠容易地分离BGSC，可以在培养物中扩增BGSC或诱导其分化为肝和胰腺谱系，并且可以作为用于再生医学临床方案的细胞来源。

相关申请的交叉引用

本申请要求2018年3月29日提交的美国临时申请62/650,208号的优先权，将其整体合并至本文中。

背景

多个干/祖细胞小体(niches)持续存在于胎儿和出生后的人胆管树内的特定解剖位置。尽管早已在胎儿组织中识别出干/祖细胞群，但它们在成年组织中的持久存在是新近才发现的。与肠隐窝平行的腺体(胆管腺PBG)位于肝外胆管、大肝内胆管和肝胰总管内。胆囊内发现了来源于PBG的较晚阶段的干细胞/祖细胞。该网络从肝胰总管PBG中的干/祖细胞延续到胰腺内胰管腺(PDG)中的定向祖细胞。所有这些小体中的干/祖细胞统称为胆管树干/祖细胞(BTSC)。PBG中的BTSC具有内胚层干/祖细胞的特性，包括增殖能力、自我更新和多能性；它们具有PDG中祖细胞的特征，包括增殖能力和多能性，但自我复制能力却低于PBG中的干/祖细胞。

位于肝胰壶腹水平的BTSC是原始的，共表达多种多能性标志物(例如OCT4、SOX2、NANOG)，可以自我更新或分化为功能性肝细胞、胆管细胞和胰岛(它们是否也可以产生腺泡细胞正在研究中)。含有BTSC的小体延伸到肝脏和胰腺中。对人体的详细解剖学研究显示，存在BTSC小体组织的近端到远端轴，其从最原始干细胞所在的近端位置(肝-胰壶腹)到成熟细胞所在的远端部位、肝脏或胰腺。该轴概括了这些器官的器官发生，并反映了它们共同的胚胎起源。实际上，从胚胎学的角度来看，肝脏、胆管系统和胰腺的共同前体在发育的早期阶段存在于形成前肠的确定性腹侧内胚层(definitive ventral endoderm)。在此发育阶段，原始十二指肠具有腹侧内胚层干/祖细胞。

鉴定出的最原始的干/祖细胞是在十二指肠粘膜下层的布鲁纳氏腺中发现的。这些细胞可能是产生肝脏和胰腺的整个干/祖细胞网络的起点。从成人十二指肠分离这些细胞是困难的，并且迄今为止还没有通过本领域公开的方法实现。这些细胞的实际意义是多方面的。例如，这些细胞可用于药物作用的体外评估，以及用于生成模型系统(例如类器官)以分析肝脏和胰腺的发育、功能、维持和/或修复(鉴于这些细胞包含这两个器官的前体)，用于与肝脏、胰腺和其他内胚层组织相关的其他临床或分析测试，以及用于诊断或治疗涉及或影响肝脏、胰腺和/或其他内胚层组织的疾病或状况。来自布鲁纳氏腺的细胞在内胚层干/祖细胞来源中是独特的，因其位置位于可通过内窥镜检查到达的十二指肠，因此可为自体或异源细胞疗法或基因疗法提供干/祖细胞来源。此外，源自这些布鲁纳氏腺的肿瘤是各种形式的癌症治疗方法的逻辑目标。因此，本领域仍然需要开发分离这些目的细胞(称为“布鲁纳氏腺干/祖细胞”)的方法。

概述

在一个方面，本公开涉及从十二指肠分离的干/祖细胞(称为布鲁纳氏腺干/祖细胞或BGSC)，其表达选自Tra-1-60、Tra-1-81、OCT4、SOX2、NANOG、EpCAM、SOX9和细胞角蛋白7(CK7)的一种或多种标志物，其进一步特征在于能够在支持自我更新的培养条件下以有限或最小限度的分化增殖。

在另一方面，本公开涉及从十二指肠分离的干/祖细胞(称为布鲁纳氏腺干/祖细胞或BGSC)，其表达选自Lgr5、NIS、CD44和CK19的一种或多种标志物，其进一步特征在于能够在支持自我更新的培养条件下以有限或最小限度的分化增殖。

在另一方面，本公开涉及从十二指肠分离的干/祖细胞(称为布鲁纳氏腺干/祖细胞或BGSC)，其表达SOX17和PDX1，其进一步特征在于能够在支持自我更新的培养条件下以有限或最小限度的分化增殖。