[发明专利]复用型催化报告分子沉积

说明书

提供了一种用于测试样品中一种或多种靶标的存在的方法，其包括复用型催化报告分子沉积(CARD)。

相关申请的交叉引用

本申请要求2018年6月8日提交的美国临时申请号62/682,765以及2018年11月13日提交的美国临时申请号62/760,450的优先权益，所有申请的内容均出于任何目的以引用的方式整体并入本文。

技术领域

本申请总体上涉及分析物(例如，靶标)检测领域，并且具体地涉及使用催化报告分子沉积(CARD)的检测方法。

背景技术

对于研究和医学应用，可能需要检测单个细胞或组织样品内的多个生物学相关分子。免疫学方法通常用于此目的。此类方法总体涉及将抗体与样品中的目标分子结合，生成与抗体相关联的可检测信号以使得每个目标分子彼此区分开，以及使用分析方法检测信号。在此类免疫学方法中已使用催化报告分子沉积(CARD)来产生与抗体相关联的增强信号。CARD的典型工作流程是将靶标分子-特异性抗体施用于样品，然后施用识别一级抗体的二级抗体。二级抗体连接到酶(例如辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶)，所述酶将底物转化为与附近的酚类残基结合的反应剂(例如酪氨酸)。因为细胞样品中酚类残基十分丰富，因此结果是在一级抗体附近有密集标记。

CARD的一个技术问题是难以从样品中去除二级抗体。当需要使用额外一级抗体来探测相同样品中的额外目标分子时，就会出现此问题。可以使用加热或微波来去除二级抗体，但是此方法可损坏样品，从而降低后续测试的质量。此外，此处理经常是耗时的。

因此，一种避免严苛的样品处理并允许在单个样品中检测多种目标分子的方法将是有用的CARD方法学改进。

发明内容

根据说明书，提供一种用于测试样品中一种或多种靶标的存在的方法，以复用催化报告分子沉积(catalyzed reporter deposition，CARD)并实现更高水平的复用检测。

在一个实施方案中，一种用于测试样品中一种或多种靶标的存在的方法包括：

(1)使正测试一种或多种靶标的存在的样品与一种或多种靶标特异性结合配偶体接触，其中每种靶标特异性结合配偶体连接到核酸链，并且其中具有不同特异性的靶标特异性结合配偶体连接到不同的核酸链；

(2)任选地去除未结合的靶标特异性结合配偶体；

(3)使来自步骤(1)或任选地步骤(2)的所述样品与连接到核酸链的酶接触，所述核酸链与连接到所述靶标特异性结合配偶体的所述核酸链互补，其中满足以下(i)或(ii)或两者：

(i)所述核酸链使用第一可释放接头来连接到所述靶标特异性结合配偶体；并且

(ii)所述酶使用第二可释放接头来连接到所述互补核酸链；

(4)任选地去除连接到互补核酸链的未结合的酶；

(5)使来自步骤(3)或任选地步骤(4)的所述样品与包含可检测地标记的底物的底物缀合物接触，其中所述底物和所述可检测标记任选地使用第三可释放接头来连接；

(6)任选地去除未结合的底物缀合物；

(7)任选地释放所述结合的酶；

(8)任选地对所述样品进行成像以检测所述结合的可检测标记；以及

(9)任选地重复步骤(1)-(8)或其任何子集，并且任选地如果使用多于一种靶标特异性结合配偶体，则在成像的步骤(8)之前重复步骤(1)-(7)或其任何子集。

在一些实施方案中，所述方法还包括在成像的步骤(8)之前重复步骤(3)-(7)。