[发明专利]用于寡核苷酸治疗剂的大规模平行发现方法

权利要求书

1.一种用于对修饰的寡核苷酸的核碱基序列测序的方法，所述方法包括步骤：

a.将捕获探针寡核苷酸连接至修饰的寡核苷酸的3’末端；

b.从捕获探针进行聚合酶介导的5'-3'第一链合成，以产生包含修饰的寡核苷酸的互补序列的核酸序列；

c.对在步骤b)中获得的第一链合成产物进行基于引物的测序。

2.一种用于对修饰的寡核苷酸群体的碱基序列进行平行测序的方法，所述方法包括以下步骤：

a.将捕获探针寡核苷酸连接至修饰的寡核苷酸群体中存在的修饰的寡核苷酸的3'末端；

b.从所述捕获探针进行聚合酶介导的5'-3'第一链合成，以产生核酸序列群体，每个核酸序列都包含所述修饰的寡核苷酸群体中存在的修饰的寡核苷酸的碱基序列的互补序列；

c.对步骤b)中获得的第一链合成产物的群体进行基于引物的平行测序。

3.根据权利要求1或2的方法，其中所述捕获探针包含第一引物结合位点，并且在第一链合成之前，将第一引物与所述捕获探针杂交以引发第一链合成。

4.根据权利要求1或2的方法，其中所述捕获探针是自引发捕获探针。

5.根据权利要求1-4中任一项的方法，其中在步骤b之后且在步骤c之前，将所述第一链合成产物进行PCR扩增。

6.根据权利要求1-5中任一项的方法，其中步骤c)包括在进行基于引物的测序之前，对步骤b.的所述第一链合成产物或权利要求5的所述PCR扩增产物进行克隆扩增。

7.根据权利要求1-6中任一项的方法，其中在将所述3'捕获探针连接到所述修饰的寡核苷酸之后，并且在第一链合成之前，对所述连接产物进行纯化，例如通过凝胶纯化或通过对所述未连接的3'捕获探针进行酶促降解。

8.根据权利要求5-7中任一项的方法，其中使用PCR引物对进行PCR步骤，其中一个PCR引物对3'捕获探针是特异的，而第二PCR引物对修饰的寡核苷酸诸如修饰的寡核苷酸的5'区域是特异的。

9.根据权利要求1-8中任一项的方法，其中所述基于引物的测序步骤包括使用克隆扩增引物对所述第一链合成步骤(b)进行克隆扩增，其中一个克隆扩增引物对所述3'捕获探针是特异的，而第二克隆扩增引物对所述修饰的寡核苷酸诸如所述修饰的寡核苷酸的5'区域是特异的。

10.根据权利要求1-7中任一项的方法，其中在所述第一链合成步骤(b)或权利要求7的所述纯化步骤之后，将衔接子探针连接在所述第一链合成产物的3'端。

11.根据权利要求10的方法，其中使用一对PCR引物进行PCR步骤，其中一个PCR引物对3'捕获探针是特异的，而另一PCR引物对衔接子探针是特异的。

12.根据权利要求10或11的方法，其中所述捕获探针和所述衔接子探针包含克隆扩增引物结合位点，并且所述测序步骤包括对权利要求10的所述第一链合成/衔接子探针连接产物或权利要求11的所述PCR扩增产物进行克隆扩增。

13.根据权利要求12的方法，其中所述克隆扩增引物对所述第一和第二PCR引物是特异的；或所述克隆扩增引物对所述3'捕获探针和衔接子探针是特异的；或分别地一个克隆扩增引物对所述PCR引物之一是特异的，而另一个克隆扩增引物对所述3'捕获探针或所述衔接子探针是特异的。

14.根据权利要求1-7中任一项的方法，其中在所述第一链合成步骤(b)之后，将所述第一链合成产物在3'端聚核苷酸(polyN)，例如聚腺苷酸化。

15.根据权利要求14的方法，其中使用具有互补poly(N)序列的引物例如多聚T引物合成第二链。