[发明专利]具有高热稳定性的经修饰核苷磷酸

说明书

本发明提供了用于通过PCR和RT‑PCR(逆转录酶‑PCR)进行核酸扩增的稳定核苷酸试剂，所述核苷酸试剂包含在末端磷酸例如在γ‑磷酸处的氟化核苷多磷酸。本发明还提供了使用氟化核苷多磷酸在扩增反应中检测样品中是否存在靶核酸序列的方法。

技术领域

本发明提供了稳定的核苷酸试剂、其合成方法、其使用方法以及包含它们的试剂盒。核苷酸试剂可用于许多重组DNA和RNA技术，尤其是通过聚合酶链反应(PCR)进行的核酸扩增。

背景技术

核酸扩增试剂通常由温度敏感组分组成，因此必须经常在远低于周围环境的温度下存储和运输。脱氧核糖核苷三磷酸腺苷或其核糖核苷三磷酸类似物尤其如此。这些试剂易于经由从末端丢失连续的磷酸基团而降解，导致形成核苷二磷酸和核苷一磷酸，它们不再是核酸聚合酶的底物。此外，二磷酸的形成会抑制酶的活性。核苷多磷酸的稳定性可以通过酯化末端磷酸来改善。例如，在末端磷酸含有甲基酯的dNTP类似物在足以完全降解正常dNTP的热应激条件下是完全稳定的。然而，末端磷酸的酯化可能对这些核苷酸用作某些聚合酶的有效底物的能力产生负面影响。因此对于既是热稳定又是聚合酶有效底物的dNTP类似物存在需求。

发明内容

本发明提供了用于通过PCR和RT-PCR(逆转录酶-PCR)进行核酸扩增的稳定的核苷酸试剂，其包含经修饰的核苷多磷酸。本发明还提供了使用经修饰的核苷多磷酸检测扩增反应中样品中靶核酸序列存在或不存在的方法。

因此，一方面，本发明涉及一种检测样品中靶核酸序列存在或不存在的方法，所述方法包括进行扩增步骤，所述步骤包括：如果样品中存在靶核酸序列，则使所述样品接触扩增试剂以产生扩增产物，并检测所述扩增产物，其中所述扩增试剂包含具有以下结构的经修饰的核苷多磷酸：

其中R＝嘌呤或嘧啶碱基或类似物，并且n＝1-4。在一个实施例中，n＝1。在另一个实施例中，n＝2。在另一个实施例中，n＝3-4。在一些实施例中，扩增步骤重复至少一次。在一些实施例中，扩增步骤重复至少约20次，但是可以重复多达至少40次，至少60次或至少100次。在一些实施例中，扩增产物在扩增发生后被检测一次。在一些实施例中，在扩增步骤期间和/或之后检测扩增产物。在一些实施例中，在3、5、10、20、30、40或50个扩增步骤期间和/或之后的限定时间点，或在每个扩增步骤期间和/或之后检测扩增产物。在一些实施例中，扩增试剂包含热稳定的无机焦磷酸酶。在一些实施例中，扩增试剂包含核酸聚合酶。在一些实施例中，核酸聚合酶具有逆转录酶活性。

在另一方面，本发明涉及一种使用扩增试剂扩增靶核酸序列的方法，其中所述扩增试剂包含具有以下结构的经修饰的核苷多磷酸：

其中R＝嘌呤或嘧啶碱基或类似物，并且n＝1-4。在一个实施例中，n＝1。在另一个实施例中，n＝2。在另一个实施例中，n＝3-4。在一些实施例中，扩增步骤重复至少一次。在一些实施例中，扩增步骤重复至少约20次，但是可以重复多达至少40次，至少60次或至少100次。在一些实施例中，扩增产物在扩增发生后被检测一次。在一些实施例中，在扩增步骤期间和/或之后检测扩增产物。在一些实施例中，在3、5、10、20、30、40或50个扩增步骤期间和/或之后的限定时间点，或在每个扩增步骤期间和/或之后检测扩增产物。在一些实施例中，扩增试剂包含热稳定的无机焦磷酸酶。在一些实施例中，扩增试剂包含核酸聚合酶。在一些实施例中，核酸聚合酶具有逆转录酶活性。

在另一方面，本发明涉及一种组合物，所述组合物包含具有以下结构的经修饰的核苷多磷酸：

其中R＝嘌呤或嘧啶碱基或类似物，并且n＝1-4。在一个实施例中，n＝1。在另一个实施例中，n＝2。在另一个实施例中，n＝3-4。

在另一方面，本发明涉及反应混合物或试剂盒，所述反应混合物或试剂盒包含核酸聚合酶、缓冲液和具有以下结构的经修饰的核苷多磷酸：