[发明专利]聚乙二醇化抗冻蛋白及其制备和使用方法

说明书

本发明涉及具有化学式AFP‑PEG的修饰抗冻蛋白，其中AFP是抗冻蛋白，PEG是聚(亚烷基二醇)基，并且PEG连接到AFP中不参与热滞后反应的氨基酸，其侧链具有选自胺、硫醇、羟基、羧酸根、酰胺和胍基的官能团。本发明还公开了修饰抗冻蛋白的化学式、使用修饰抗冻蛋白保护生物组织、器官或身体的方法以及合成修饰抗冻蛋白的方法。

技术领域

本发明涉及抗冻蛋白(AFP)，特别是包含连接一个或多个聚乙二醇(PEG)基团的AFP，及其制备和使用方法(例如：用于生物医学应用和/或冷冻保存)。

背景技术

迄今为止，人类已经在包括鱼类、昆虫和植物在内的各种生物中发现了抗冻蛋白(AFP)，这些抗冻蛋白可保护上述生物的活细胞在零度以下的环境中免受冻害。

北极鱼能够在水温为-1.9摄氏度的寒冷环境中生存[Scholander et al.,J.Cell.Compar.Physiol.,49(1957)5-24]。DeVries等人在1960年代发现北极/南极鱼类体内含有称为抗冻蛋白(AFP)的特定蛋白质，这种蛋白质可帮助鱼类在恶劣的水温下生存[DeVries et al.,Science,163(1969)1073-1075]。已经分离出的第一种鱼类AFP是抗冻糖蛋白(AFGP)。在南极抗冻鱼和北部鳕鱼体内均发现了这些蛋白质，分子量在2.6kDa和3.3kDa之间。它们由两个关键的结构特征组成：(1)(Thr-Ala-Ala)_n的三肽重复键，以及(2)苏氨酸的羟基上附着有二糖[Harding et al.,Eur.J.Biochem.,270(2003)1381-1392；Knight et al.,Biophys.J.,64(1993)252-259；Chao et al.,Biochemistry,36(1997)14652-14660]。第二类鱼类抗冻蛋白没有与之相连的糖，并且进一步分类为I型，II型，III型和IV型AFP。在三斑沙鲽鱼中发现了I型AFP，其分子量为3.3kDa至4.5kDa[Duman et al.,Comp.Biochem.Physiol.B.,54(1976)375–380]，富含丙氨酸，并且具有单个α-螺旋结构作为其二级结构[Harding et al.,Eur.J.Biochem,264(1999)653-665；Davies et al.,FASEBJ.,4(1990)2460-2468；Yeh et al.,Chem.Rev.,96(1996)601-618；Wu et al.,Comp.Biochem.Physiol.B Biochem.Mol.Biol.,128(2001)265-273]。在大牛尾鱼、胡瓜鱼和鲱鱼中发现了II型抗冻蛋白[Ng et al.,J.Biol.Chem.,267(1992)16069-16075]。它们的分子量在11kDa和24kDa之间，并且具有包括二硫键的混合二级结构。II型AFP估计有120个氨基酸残基(富含半胱氨酸)。已知II型AFP的两种天然来源(胡瓜鱼和鲱鱼)是钙依赖性的，因为Ca²⁺离子直接参与其冰绑定活动[Yeh,supra；Ewart et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.,185(1992)335-340；Jia et al.,Nature,384(1996)285-288]。在海洋鲇鱼、南极鲇鱼和狼鱼中发现了III型AFP[Sonnichsen et al.,Science,259(1993)1154-1157；Sonnichsen et al.,Structure,4(1996)1325-1337；Garnham et al.,Biochemistry,49(2010)9063-9071]。它们的分子量从6kda到7kda，总共有62-69个氨基酸残基。在III型AFP中发现了超过12种亚型[Hew et al.,J.BiologicalChem.,263(1988)12049-12055]。它们具有β三明治二级结构和球状三级结构。在大西洋西北区域的长角杜父鱼中发现了IV型AFP[Deng et al.,FEBS Lett.,402(1997)17-20]。它们的分子量约为12kDa，含有约108个氨基酸残基。IV型抗冻蛋白的二级结构具有α螺旋，三级结构具有螺旋束[同上]。