[发明专利]末端脱氧核苷酸转移酶的变体及其用途

说明书

本发明涉及末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)的变体，该变体(i)包含如SEQ ID N°2中列出的氨基酸序列或功能等同序列，以及在对应于残基C302的位置处的至少一个氨基酸取代或功能等同残基，其中该位置参考SEQ ID N°1中列出的氨基酸序列编号，(ii)能够在没有模板的情况下合成核酸片段，以及(iii)能够将修饰的核苷酸掺入到核酸片段中。

发明领域

本发明涉及末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)的变体及其用于在没有模板的情况下酶促合成核酸序列的用途。更特别地，本发明涉及适于掺入修饰的核苷酸的此类变体，用于合成具有确定的或受控的序列的核酸分子。

背景

在过去的40年中，基于固相亚磷酰胺化学的核酸的从头化学合成方法得到了广泛使用和完善。该技术由四步链延伸循环构成，每个循环将一个碱基添加到附接到固体支持基质的生长的寡核苷酸链上。尽管在过去的几十年期间，该技术一直是合成核酸的首选方法，但其具有一些明显的限制：其需要使用多种溶剂和试剂，并且由于化学反应效率的限制，合成的寡核苷酸的长度通常不超过150-200个碱基。此外，这些短片段需要被进一步组装以提供期望的DNA序列。

化学合成的一种替代方法包括使用将可逆的终止剂(terminator)修饰的核苷酸添加到生长的单链的核酸链中的非模板依赖性DNA聚合酶。这允许以受控的方式每个循环添加一种类型的核苷酸。

一些天然的酶能够在缺乏模板的情况下作用于天然核苷酸，并且因此能够以不受控制的方式催化核酸的合成。然而，它们在掺入修饰的核苷酸，并且更特别地在掺入可逆的终止剂修饰的核苷酸时效率特别低。已经为开发能够作用于修饰的核苷酸的新的DNA聚合酶做出了努力，但是所得的酶在合成任何类型的核酸的性能方面并不完全令人满意。

迄今，只有很少的能够有效作用于单链DNA(在不使用模板的情况下)的DNA聚合酶被鉴定。具有这种非模板依赖性活性的表征最完全的聚合酶是末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)。TdT酶已被广泛用于修饰单链DNA用于多种类型的应用，包括生物技术、生物医学研究和合成生物学。然而，天然TdT几乎不能使用修饰的核苷酸。

已进行了开发具有可接受的掺入修饰的核苷酸的性能的修饰的TdT的一些尝试。然而，掺入这样的修饰的核苷酸的性能仍然是限制因素。掺入效率是驱动合成的整体纯度和产率的关键参数。合成方法的这两个特征对核酸产物的质量、周转时间和成本具有重要影响。

因此，需要开发能够在不存在模板的情况下使用修饰的核苷酸的改进的TdT，以开发用于核酸合成的高效且成本有效的方法。

发明概述

通过研究用于从头合成具有受控的序列的多核苷酸并且不使用模板的TdT，本发明人已经发现TdT催化结构域的一些被靶向的氨基酸残基可以被特异性修饰以提高这样的修饰的TdT合成多核苷酸的能力。更特别地，本发明人已经开发了具有被靶向的氨基酸取代(targeted amino acid substitution(s))的修饰的TdT，所述被靶向的氨基酸取代导致合成定制核酸的总成本降低(即使用修饰的核苷酸)。修饰的TdT可以呈现出与野生型TdT相比的一个或更多个被靶向的氨基酸取代。更特别地，修饰的TdT至少呈现出具有一个或更多个被靶向的氨基酸取代的催化结构域(SEQ ID N°2)的氨基酸序列。本发明的非模板依赖性聚合酶允许更快、更便宜且质量更好地合成多核苷酸。

因此，本发明的一个目的是提供一种末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)的变体，该变体(i)包含如SEQ ID N°2中列出的氨基酸序列或功能等同序列，以及在对应于残基C302的位置处的至少一个氨基酸取代或功能等同残基，其中该位置参考SEQ ID N°1中列出的氨基酸序列编号，(ii)能够在没有模板的情况下合成核酸片段，以及(iii)能够将修饰的核苷酸掺入到核酸片段中。

在特定实施方案中，取代选自C302G/R/P/A/V/S/N/Q/D，优选地选自C302G/R。