[发明专利]用于在线粒体内表达蛋白质的核酸、包封有所述核酸的脂质膜结构体和它们的应用

说明书

本发明涉及将下述a)至d)中任一者所示的核酸包封而成的线粒体靶向性脂质膜结构体。a)一种RNA，其为依次包含第一线粒体tRNA的碱基序列、编码目标蛋白质的mRNA的碱基序列和第二线粒体tRNA的碱基序列的RNA，上述mRNA的碱基序列具有作为色氨酸密码子的一个或两个以上的UGA；b)一种DNA，其包含启动子的碱基序列和与a)的RNA互补的碱基序列；c)一种RNA，其为包含编码目标蛋白质的mRNA的碱基序列和存在于其3’末端侧的多聚A链的碱基序列的RNA，上述mRNA的碱基序列具有作为色氨酸密码子的一个或两个以上的UGA、作为起始密码子的AUG和作为终止密码子的UAA；d)一种DNA，其包含启动子的碱基序列和与c)的RNA互补的碱基序列。

技术领域

本发明涉及用于在线粒体内表达蛋白质的核酸、包封有上述核酸的线粒体靶向性脂质膜结构体、上述核酸或上述脂质膜结构体在药物组合物中的使用或细胞制剂的制造中的使用、以及用于对作为线粒体蛋白的ND3的点突变进行定量的引物DNA组。

背景技术

作为细胞的细胞器之一的线粒体包含在细胞核内由核基因组DNA转录翻译并被移送至线粒体内的线粒体蛋白(来源于核DNA的线粒体蛋白)、以及由独立于细胞核的线粒体基因组DNA所编码并在线粒体内进行转录翻译的线粒体蛋白(来源于线粒体DNA的线粒体蛋白)。编码这些蛋白质的基因组DNA中的突变与各种疾病(脑肌病、神经变性疾病、癌症、糖尿病等)的相关性已有很多报道，将这些疾病统称为线粒体病。以下，只要没有特别声明，本发明以人的线粒体作为代表例来进行说明。另外，只要没有特别声明，术语“线粒体蛋白”作为包含来源于核DNA的线粒体蛋白和来源于线粒体DNA的线粒体蛋白的术语来使用。

目前，正在进行研究开发的线粒体病的治疗方法之一是基因治疗，其目的在于将可期待治疗效果的蛋白质、例如与突变的线粒体蛋白对应的野生型蛋白送入线粒体内。为了实现基因治疗，提出了能够将在细胞核内转录并在细胞质中翻译的目标蛋白质移送至线粒体内的外源基因表达系统和能够在线粒体内直接表达目标蛋白质的外源基因表达系统等。

与在细胞质中表达的目标蛋白质向线粒体内的移送相关地开发了多种多样的表达载体。其中大多利用来源于核DNA的线粒体蛋白所具有的线粒体靶向信号肽(mitochondrial targeting signal peptide、MTS)。具体而言，将编码在上游具有MTS的目标蛋白质(MTS附加蛋白)的表达载体送达至细胞核中，使MTS附加蛋白在细胞质中表达，并送达至线粒体中。

该方法存在下述问题：虽然对某种目标蛋白质可能有用，但对于来源于线粒体DNA的线粒体蛋白的适用性低。这是因为，来源于线粒体DNA的线粒体蛋白大多在细胞质内为不溶性，因此在细胞质中表达的来源于线粒体DNA的线粒体蛋白会发生凝聚，向线粒体中的转移变得不充分。

专利文献1公开了使用编码由提高了水溶性的MTS和特定的来源于线粒体DNA的线粒体蛋白构成的MTS附加蛋白的表达载体来抑制目标蛋白质在细胞质中的凝聚的方法。但是，来源于线粒体DNA的线粒体蛋白在处于线粒体以外的细胞内细胞器时多会显示出细胞毒性，因此可利用专利文献1中记载的方法的目标蛋白质的范围受限。

另外，利用MTS附加蛋白的上述方法会干扰原来的线粒体蛋白的细胞内输送或者与其竞争，因此有可能给细胞造成致死性损伤，作为基因治疗的工具令人担忧。

另一方面，利用能够在线粒体内直接表达目标蛋白质的外源基因表达系统时，首先要求线粒体内的必要充分量的目标蛋白质的转录表达。为了符合该目的，选择来源于线粒体基因组DNA中存在的基因的启动子、例如HSP(重链启动子，heavy strand promoter)，设计出若干种载有在其调控下编码目标蛋白质的DNA的表达载体。还设法在该表达载体中使用线粒体基因组DNA中利用频率高的三联体密码子。但是，迄今为止，这些表达载体的表达水平尚未达到对于疾病治疗而言必要充分的区域。