[发明专利]弹性蛋白测定

说明书

本文描述了单克隆抗体、测定试剂盒和用于定量患者生物流体样品中具有C端氨基酸序列LPGGYGLPYT(SEQ ID NO:1)的弹性蛋白片段的免疫测定方法，以及它们在检测或定量纤维化疾病诸如慢性阻塞性肺疾病(COPD)中的用途。

技术领域

本发明涉及弹性蛋白测定和其在评估纤维化疾病诸如COPD中的用途。

背景技术

慢性阻塞性肺疾病(COPD)的特征在于气道炎症、中性粒细胞和肥大细胞浓度过高(1，2)。中性粒细胞和肥大细胞在响应促炎介质而从中释放的颗粒中合成并存储预先形成的丝氨酸蛋白酶，如组织蛋白酶G(CG)和蛋白酶3(PR3)。这些蛋白酶在一起具有针对细胞外基质(ECM)的广谱活性(3，4)。弹性纤维是肺的细胞外基质的主要不溶性组分，并且对细胞外基质的结构、功能、弹力以及弹性来说至关重要。弹性纤维由包埋在原纤蛋白微纤维中的交联弹性蛋白的内核芯构成(5)。它们在整个呼吸树上形成细且高度分支的网络，以支持呼吸期间肺泡的扩张和回缩。它们的特征在于健康的成人组织中的高稳定性和较低的转化。除选定的MMP外，只有少数蛋白酶诸如丝氨酸蛋白酶能够通过破坏弹性蛋白核心和微纤维来裂解弹性蛋白纤维(6-8)。在正常的炎性反应中，通过分泌内源性蛋白酶抑制剂(例如，硫酸乙酰肝素)来维持蛋白酶-抗蛋白酶的平衡(9)。在病理状态下，这一平衡被打破，导致弹性丧失，而这是COPD和肺气肿的主要病理特征(10，11)。已经提出丝氨酸蛋白酶CG和PR3在COPD中均被上调，但是目前没有能够将弹性蛋白降解的增加与那些蛋白酶相联系的标志物。

本发明人现在已经开发了一种用于监测弹性蛋白的PR3降解的免疫测定，并证明了其在评估纤维化疾病，特别是COPD中的用途。

发明内容

相应地，本发明的第一方面涉及一种用于定量患者生物流体样品中具有C端氨基酸序列LPGGYGLPYT(SEQ ID NO:1)的肽的免疫测定方法，所述方法包括使所述患者生物流体样品与和所述C端氨基酸序列LPGGYGLPYT(SEQ ID NO:1)特异性反应的单克隆抗体接触，并且确定所述单克隆抗体和所述C端氨基酸序列之间的结合量。

优选地，所述单克隆抗体不特异性识别或结合所述C端氨基酸序列的C伸展的延长版本或所述C端氨基酸序列的C截短的缩短版本。在这一方面，“所述C端氨基酸序列的C伸展的延长版本”是指一种或多种氨基酸伸展超过所述序列LPGGYGLPYT-COOH(SEQ ID NO:1)的C端。例如，如果所述C端氨基酸序列LPGGYGLPYT-COOH(SEQ ID NO:1)延长一个苏氨酸残基，那么相应的“C伸展的延长版本”将是LPGGYGLPYTT-COOH(SEQ ID NO:2)。类似地，“所述C端氨基酸序列的C截短的缩短版本”是指一种或多种氨基酸从所述序列LPGGYGLPYT-COOH(SEQID NO:1)的C端移除。例如，如果所述C端氨基酸序列LPGGYGLPYT-COOH(SEQ ID NO:1)缩短一个氨基酸残基，那么相应的“C截短的缩短版本”将是LPGGYGLPY-COOH(SEQ ID NO:3)。

所述患者生物流体样品可以为，但不限于血液、尿液、滑液、血清、BALF(支气管肺泡灌洗液)或血浆。

免疫测定可以为，但不限于竞争测定或夹心测定。类似地，免疫测定可以为，但不限于酶联免疫吸附测定或放射免疫测定。

在第二方面，本发明涉及一种用于检测或定量患者的纤维化疾病的免疫测定方法，所述方法包括使患者生物流体样品与和C端氨基酸序列LPGGYGLPYT(SEQ ID NO:1)特异性反应的单克隆抗体接触，确定所述单克隆抗体与包括所述C端氨基酸序列的肽之间的结合量，并且将所述结合量与以下相关联：i)与正常健康受试者相关的值和/或ii)与已知纤维化疾病严重程度相关的值和/或iii)在先前时间点从所述患者获得的值和/或iv)预定的截断值。

优选地，所述纤维化疾病为慢性阻塞性肺疾病(COPD)。