[发明专利]α-溶血素变体及其用途

说明书

本文描述了具有至少一个突变(诸如突变为正电荷)的α‑溶血素的变体。在某些实例中，所述突变选自成熟、野生型α‑溶血素氨基酸序列中的0K、A1K、A1R、D2N、S3K、D4K、D4N、K8R、N47K、E70K、S106K、E111N、127‑131G、D128K、K147N、V149K、E287R、M298A或其组合。还提供了包含所述α‑溶血素变体的组合物、包含所述α‑溶血素变体的纳米孔组装体和引入了其的核酸测序方法。

技术领域

公开了与金黄色葡萄球菌(Staphylococcal aureaus)α-溶血素变体相关的组合物和方法。所述α-溶血素(α-HL)变体可用作例如用于确定聚合物序列信息的设备中的纳米孔组分。本文所述的纳米孔、方法和系统采用具有改善的特征的基于纳米孔的单分子技术提供单链核酸诸如DNA、RNA等的定量检测。

背景

溶血素是由多种生物体产生的蛋白毒素家族的成员。一些溶血素(例如α溶血素)可以通过在膜中形成孔或通道来破坏细胞膜(例如，宿主细胞膜)的完整性。由成孔蛋白在膜中形成的孔或通道可以用于将某些聚合物(例如，多肽或多核苷酸)从膜的一侧运输到另一侧。

Alpha-溶血素(也称作α-溶血素、α-HL、a-HL或alpha-HL)是在宿主细胞膜中形成通道的自组装毒素。α-HL已成为纳米孔测序界的主要组分。它具有许多有利的性质，包括高稳定性、自组装和足够宽以容纳单链DNA、但不容纳双链DNA的孔径(Kasianowicz等人,1996)。

以前关于a-HL孔中DNA检测的工作已经集中在分析随着DNA通过孔转移的离子电流特征(Kasianowicz等人, 1996, Akeson等人, 1999, Meller等人, 2001)，考虑到转移速度(在100 mV为~1 nt/μs)和离子电流信号中的固有噪声，这是一项非常困难的任务。通过掺入永久束缚到孔内部的探针分子，已经在基于纳米孔的传感器中实现了更高的特异性(Howorka等人, 2001a和Howorka等人, 2001b; Movileanu等人, 2000)。

野生型α-HL导致显著数目的缺失错误，即没有测量到碱基。因此，需要具有改善的性质的α-HL纳米孔。

发明概述

如本文所述，提供了含有氨基酸变异的突变葡萄球菌alpha溶血素(也称作α-溶血素 、α-HL、a-HL或alpha-HL)多肽，所述氨基酸变异减少穿入时间(time to thread)，例如减少捕获目标分子的时间。例如，公开的变体减少关注的分子(例如，各种带标签的核苷酸或待测序的核苷酸)的穿入时间。

在某些示例方面，α-溶血素(α-HL)变体在对应于SEQ ID NO:14(成熟的野生型α溶血素序列)的 0K、A1K、A1R、D2N、S3K、D4K、D4N、K8R、N47K、E70K、S106K、E111N、127-131G、D128K、K147N、V149K、E287R、M298A或其组合中的任一个的位置包含取代。α-溶血素的取代也可以是正电荷。α-溶血素变体还可以包括在SEQ ID NO:14的H144A的取代。在某些方面，α-溶血素变体还可以包括在SEQ ID NO:14的残基127-131的一个或多个甘氨酸残基，诸如跨越SEQ ID NO:14的残基127至131的整个长度的一系列甘氨酸残基。