[发明专利]生产含重组人碱性磷酸酶的转化植物细胞的方法以及含重组人碱性磷酸酶的转化植物细胞的用途

说明书

本发明涉及食品工业和医学，并描述了生产含有重组人碱性磷酸酶的转化植物细胞的方法。本方法包括构建具有人碱性磷酸酶基因的植物表达载体，将具有人碱性磷酸酶基因的植物表达载体导入农杆菌菌株，生产植物愈伤组织细胞，使用农杆菌菌株农杆菌转化愈伤组织细胞；从转化的愈伤组织细胞产生体细胞胚，并在悬浮培养中培养含有人碱性磷酸酶基因的体细胞胚。本发明的目的是调节胃肠道微生物群落以及保护和恢复人体免疫系统。

技术领域

本发明涉及食品工业和医学，并描述了生产含有重组人碱性磷酸酶的转化植物细胞的方法，及其在维持胃肠道(GI道)稳态中的用途。

背景技术

众所周知，肠是重要的屏障器官，由正常的(生态上与人类关联的)微生物群落、粘膜层、上皮和上皮下免疫系统组成。肠屏障的主要功能是保护生物体，使其免于细菌转移到体循环中。正常的微生物群落可以留在肠腔内而不刺激宿主的免疫反应，然而相同的细菌如果通过肠屏障转运进入血液并转运到其他器官，则可以诱导免疫反应和炎症。肠壁屏障的破坏会导致对同向细菌成分过度的免疫反应，进而导致慢性炎症性肠病(IBD)的发展，例如克罗恩病和非特异性溃疡性结肠炎(Podolsky，2010)。包括药物在内的异源物质的压力、感染、衰老和毒性作用在这些疾病的发展中也起着重要的作用(Cadwell等，2010)。

当前，维持胃肠道稳态的唯一可广泛使用的手段包括调节胃肠道微生物群落和免疫系统，其是基于益生菌、由肠道中正常存在的物种组成的活微生物培养物的药物和产品。然而，尚无令人信服的证据证明此类产品具有临床功效。此外，外部引入的微生物群落通常无法在人体中生存，而被天然存在的微生物群落所排斥。而且，益生菌通常是两种细菌：乳杆菌和双歧杆菌，而人的微生物群落包括超过300多种细菌。因此，停止使用益生菌后，通常会重新出现胃肠道稳态初始的不稳定。

然而，认为基于使用碱性磷酸酶(AP)酶调节胃肠道动态平衡新方法是有前途的，因为微生物群落、免疫系统和肠屏障功能的紊乱以及IBD的发展在很大程度上由炎症诱导剂引发，其中一些是AP酶的生理底物。最有效的炎症诱因是：1)脂多糖(LPS)–大肠杆菌和其他革兰氏阴性细菌的细菌内毒素；2)细胞外ATP和其他核苷酸和核苷。肠道微生物群落不断释放LPS，当肠屏障被破坏时LPS会进入血液，甚至在最低浓度(ng/kg)时也会引起炎症。在此过程中，LPS与巨噬细胞表面的膜蛋白CD14结合，导致其活化，进而导致数十种生物活性化合物的表达：前列腺素、一氧化氮和细胞因子，包括白介素和TNFα(内森，1987年)。LPS和细胞外ATP是对“异物”和“危险”信号响应而发展全身免疫和炎症反应的重要因素(Matzinger，2002年)。

肠道粘膜细胞产生的肠道碱性磷酸酶通过使LPS失活(解毒)和防止LPS移位、调节肠道微生物群落和肠道表面pH值而在肠道稳态中发挥重要作用(Eskandari等，1999；Weemaes等，2002；Riggle等，2013；Tuin等，2009)。AP催化的LPS脱磷酸作用消除了其促炎活性，从而保护了机体免受各种炎症和自身免疫性疾病的发展(Park，Lee，2013)。

在炎性肠病、腹腔疾病和肥胖症中观察到由于编码AP的基因表达降低而导致的肠道AP正常水平(活性)中断。对患有结肠炎的小鼠口服AP可降低促炎细胞因子TNFα和一氧化氮的mRNK水平(Muginova等，2007)。Molnar等人(2012)已证明，克罗恩病和非特异性溃疡性结肠炎患儿发炎的肠粘膜中的AP水平明显低于对照组。对活动性肠道炎症患者给予外源性AP可预防疾病恶化。在另一项研究中已证明，外源性AP的给药可减轻新生动物的肠炎症，所以提出将AP用于预防新生婴儿的炎症性疾病(Biesterveld等，2015)。