[发明专利]用于确定微生物浓度的方法

说明书

本发明提供了从包含微生物和哺乳动物细胞的样品制备完整微生物的悬浮液的方法，其包括使样品与pH为至少pH 6且小于pH 9的缓冲溶液、洗涤剂和一种或多种蛋白酶接触以允许哺乳动物细胞裂解；通过适合保留微生物的过滤器过滤混合物，以除去裂解的哺乳动物细胞；将过滤器保留的微生物重悬于液体中，以提供包含回收的完整微生物的悬浮液；以及通过以下方法确定悬浮液中微生物的浓度：i.将悬浮液的等分试样加热和/或与醇接触；ii.任选地在步骤(i)之前、期间和/或之后稀释悬浮液的一个或多个等分试样以提供一个或多个稀释的等分试样；iii.使步骤(i)或(ii)的等分试样的至少一部分与能够结合DNA的单一荧光染色剂接触；iv.将步骤(iii)的混合物在荧光染色剂的发射波长下成像，并确定成像混合物中对应于微生物的物体的数目的图像分析值；以及v.将图像分析值与预定的校准曲线进行比较，从而确定悬浮液中微生物的浓度。

本发明一般地涉及样品中微生物的检测和表征。特别地，本发明提供了用于从包含微生物细胞和非微生物细胞二者的样品中回收微生物并快速测量从样品中回收的完整微生物的浓度的方法。完整微生物可能是活的。

传统上，通过测量样品的光学参数(例如它的浊度)来确定样品中的微生物生长和微生物的浓度。例如，McFarland标准在微生物学中用作样品浊度的参考，因此样品中的微生物(通常为细菌)的数目将在给定的浊度范围内，并且此类标准可用在浊度计中以确定样品中微生物的浓度。可以使用替代技术(包括分光光度法)来确定样品中微生物的浓度。然而，尽管快速且易于实施，但是这样的技术仅能够近似得到样品中的微生物数目。浊度或特定波长的光的吸光度与样品中微生物浓度之间的关系还随不同的微生物物种而变化，使得当不清楚所讨论的微生物的身份时，很难评估微生物的浓度。此外，这类技术仅能够测量样品的总浊度或吸光度，因此不能区分样品中的完整微生物或细胞或其他碎片。样品中微生物的浓度的浊度测量还具有低灵敏度，并且为了能够测量样品中微生物的浓度需要相对较高的微生物浓度。这阻止了以这种方式测量低浓度，并且在进行测量之前可能还需要延长的培养步骤。

也可以通过将样品的一部分(或稀释的部分)在固体生长培养基上铺板，孵育样品并对形成的菌落数目进行计数来更定量地估算样品中完整微生物的数目。经铺板的样品中菌落形成单位(CFU)的数目被认为对应于活微生物的数目。然而，这种技术的缺点在于，其需要漫长的孵育步骤以使得微生物生长进行足够的时间。因此，这样的经典技术可用于在特定的时间点测量样品中微生物的浓度，但是在快速需要完整微生物的浓度的情况下具有有限的用途，例如以对样品中的微生物进行测试或测定，其需要样品中存在的微生物数目的先验知识。

在微生物检测领域中周知，活的(即活)细胞也可以与死细胞区分开，并且许多技术可用于此目的。本领域已知的方法集中于核酸染色剂、膜电位、氧化还原指示剂或报道基因。通常，这些技术依赖于活的微生物的膜是完整的，而死亡的微生物的膜破裂和/或破坏的事实(Gregori等人.2001.Appl.Environ.Microbiol.67,4662-4670)。

允许将死细胞与活细胞分开的一种特定技术是活/死染色。通过使用不可透过膜的染料或染色剂，仅具有破损膜的细胞才被染色，而具有完整膜的细胞则不会。染料/染色剂因此用作死细胞的标志物，因为仅具有破损膜的那些细胞(即死细胞)才被这样的染料染色。以这种方式，可以检测死细胞，并且此外可以计算总死细胞的比例。该领域的进一步发展已导致开发使用两种不同的染色剂的技术：第一种是细胞可渗透的，并且可进入活细胞和死细胞二者；第二种是细胞不可渗透的，并且只能进入死细胞。因此，可以对活细胞和死细胞进行差异标记，并且从而可以进行区分。用于执行此技术的试剂盒的一个实例是LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit(Invitrogen)，其包含SYTO9(细胞可渗透的)染色剂和碘化丙啶(PI)(细胞不可渗透的)荧光染色剂。通过在这样的试剂盒中使用的第一染色剂和第二染色剂二者的发射波长处检测微生物细胞，这样的技术可特别用于区分活微生物和死微生物，从而确定样品中存在的活微生物的比例。