[发明专利]细胞色素P450单加氧酶催化的倍半萜的氧化

权利要求书

1.一种生产氧化的子杂烯化合物的方法，该方法包括：

a.使子杂烯或含子杂烯的组合物与具有细胞色素P450单加氧酶活性的多肽接触，该多肽选自：

i.VzCP8201，其包含与SEQ ID NO:19具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，

ii.VzCP521-11，其包含与SEQ ID NO:21具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，

iii.VzCP7186，其包含与SEQ ID NO:20具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，

iv.或至少两种所述多肽的组合；

从而获得至少一种子杂烯的氧化产物，

b.可选地，将步骤a中获得的子杂烯氧化产物分离。

2.权利要求1的方法，其中步骤a在氧气存在下在细胞培养物中在体内进行；或在氧气存在下在液体反应介质中在体外进行。

3.权利要求1和2中任一项的方法，其中步骤a通过在子杂烯或含子杂烯的组合物的存在下，在有助于子杂烯氧化的条件下，培养非人宿主生物或细胞来进行，该非人宿主生物或细胞表达至少一种所述具有细胞色素P450单加氧酶活性的多肽。

4.前述权利要求之一的方法，其中步骤a中的子杂烯的转化在具有P450还原酶(CPR)活性的多肽存在下进行。

5.权利要求4的方法，其中所述CPR包含与SEQ ID NO:23具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。

6.前述权利要求之一的方法，还包括在步骤a之前，在具有子杂烯合酶活性的多肽存在下，将法呢基焦磷酸(FPP)环化。

7.权利要求6的方法，其中所述具有子杂烯合酶活性的多肽包含与SEQ ID NO:33、38或42具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。

8.前述权利要求之一的方法，其通过在细胞培养物中通过施加内源性产生FPP的微生物来进行。

9.权利要求8的方法，其中所述微生物经遗传修饰以产生增加量的FPP。

10.前述权利要求之一的方法，还包括步骤c，将子杂烯醇转化为子杂烯酮，或转化为包含子杂烯酮和表子杂烯酮的混合物。

11.权利要求10的方法，其中步骤c包括在至少一种具有子杂烯醇氧化活性的多肽的存在下，在细胞培养物中或在液体反应介质中的化学氧化或生物化学氧化。

12.权利要求11的方法，其中步骤c通过在子杂烯醇或包含子杂烯醇的组合物的存在下，在有助于子杂烯醇氧化的条件下，培养非人宿主生物或细胞来进行，该非人宿主生物或细胞表达至少一种具有子杂烯醇脱氢活性的多肽。

13.前述权利要求之一的方法，其中所述具有细胞色素P450单加氧酶活性的多肽选自：

i.VzCP8201，其包含与SEQ ID NO:19具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，其在N末端延伸了至少一个氨基酸残基，

ii.VzCP521-11，其包含与SEQ ID NO:21具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，其在N末端延伸了至少一个氨基酸残基；和

iii.VzCP7186，其包含与SEQ ID NO:20具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，其在N-末端延伸了至少一个氨基酸残基。