[发明专利]一种以丁香酚为底物发酵生成香兰素的方法

说明书

本发明公开了一种以丁香酚为底物发酵生成香兰素的方法，通过Penicillium simplicissimum OMK‑68和Bacillus sp.OMK‑69混合发酵获得香兰素，效价高达35g/L，丁香酚质量转化率为83.3％。本发明中的Penicillium simplicissimum OMK‑68能够以丁香酚为底物，发酵生产松柏醇，其发酵效果和底物利用率均远好于野生型Penicillium simplicissimum。本发明中的Bacillus sp.OMK‑69能够以松柏醇为底物，发酵生产香兰素，其发酵效果和底物利用率均远好于野生型Bacillus sp。

技术领域

本发明属于香兰素制备技术领域，具体涉及一种以丁香酚为底物发酵生成香兰素的方法。

背景技术

香兰素是目前全球使用最多的食品赋香剂之一，有“食品香料之王”的美誉，是截止2019年全球产量最大的香料之一。

香兰素天然存在于香荚兰豆等植物中。可从热带香草兰花的豆荚中提取香兰素，由于香草兰花荚植物对土壤及气候因素的要求非常高，而且天然加工的处理工艺复杂，所以香兰素的天然来源非常有限。从天然植物中提取的香兰素产品在全球产量中的占比不到1％。

为满足市场的需求，人们开始开发生物法合成香兰度的研究。早些时间Achterholt等开发了以阿魏酸为底物生物合成香兰素的工艺。生物法转化阿魏酸合成香兰素也是目前生物法合成香兰素最成熟的工艺。稍后人们还研究了以丁香酚为底物，通过微生物代谢积累香兰素的研究。WO 0026355披露了利用Pseudomonas sp.HR199生物转化丁香酚产生了2.6g/L的香兰素。Zhao，L.Q.等研究了利用Bacillus fusiformis SW-B9代谢异丁香酚产生了32.5g/L的香兰素等等。

发明内容

本发明的目的在于提供一种以丁香酚为底物发酵生成香兰素的方法。

本发明的具体技术路线如下：

本发明的技术方案之一如下：

一种以丁香酚为底物发酵生成香兰素的方法，通过Penicillium simplicissimumOMK-68和Bacillus sp.OMK-69混合发酵获得香兰素；

其中，Penicillium simplicissimum OMK-68于2019年10月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2019827；Bacillussp.OMK-69于2019年10月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2019826。

在本发明的一个优选实施方案中，包括如下步骤：

(1)将Penicillium simplicissimum OMK-68和Bacillus sp.OMK-69经无菌YPD平板培养后，再分别经第一种子培养基和第二种子培养基活化，获得Penicilliumsimplicissimum OMK-68种子液和Bacillus sp.OMK-69种子液；

(2)将Penicillium simplicissimum OMK-68种子液接种于无菌的所述发酵培养基中，于发酵罐中进行发酵培养10-13h；

(3)将Bacillus sp.OMK-69种子液接种于步骤(2)所得的物料中，继续于发酵罐中进行发酵培养9-11h；

(4)在步骤(3)所得的物料中加入底物丁香酚，然后每间隔3-5h再添加与第一次添加等量的丁香酚，共添加5-7次，累计共添加丁香酚39-45g/L；

(5)在步骤(4)所得的物料中，纯化获得香兰素。