[发明专利]一种土壤中反硝化细菌NosZ基因绝对定量检测的引物和试剂盒

权利要求书

1.一种土壤中反硝化细菌NosZ基因绝对定量检测的引物的扩增方法，包括土壤基因组DNA的提取-标准品构建-土壤氮素代谢基因nosZ引物-定量PCR反应体系-计算扩增效率-样品检测验证步骤，具体步骤如下：

1、土壤基因组DNA的提取：采用天根土壤基因组DNA提取试剂盒(DP336)提取DNA，洗脱收集DNA，约80ul，取10ul稀释至300ul用于检测；

2、标准品构建：采用基因合成的方式构建标准品，序列为：GCCACAACCACACCTCCATGGGCCAGACCAAGGAGGCAGATGGCAAGTGGCTGATCTCGCTGAACA；

3、土壤氮素代谢基因nosZ引物：nosZ_2F引物序列为：GCCACAACCACACCTCCAT，引物长度为66；

4、定量PCR反应体系：定量PCR反应程序：预变性的温度与时间为：95摄氏度、10分钟，变性的温度与时间为：95摄氏度、10秒，退火延伸的温度与时间为：60摄氏度、40秒；

5、计算扩增效率：将步骤2构建好的标准品溶解以后，10倍梯度稀释，拟合标准曲线，计算扩增效率，本引物标准曲线方程为：Y＝-3.3873+35.5083，R2为：99.89％，扩增效率为97.34％；

6、样品检测验证：以步骤1提取的DNA为模板，检测引物的扩增情况，样品检测CT值在24-28之间，计算出的每克土壤nosZ基因的拷贝数。

2.根据权利要求1所述的一种土壤中反硝化细菌NosZ基因绝对定量检测的引物的扩增方法，其特征在于：步骤3中引物为，nosZ_2R，引物序列为TGTTCAGCGAGATCAGCCA与nosZ_2F。

3.根据权利要求1所述的一种土壤中反硝化细菌NosZ基因绝对定量检测的引物的扩增方法，其特征在于：步骤4中反应体系在冰上配制，体系配制过程中带塑料手套操作，且手不能触碰PCR管。

4.根据权利要求1所述的一种土壤中反硝化细菌NosZ基因绝对定量检测的引物的扩增方法，其特征在于：步骤6中计算出的每克土壤nosZ基因的拷贝数在10⁵-10⁷之间。

5.据权利要求1所述的一种土壤中反硝化细菌NosZ基因绝对定量检测的引物的扩增方法，其特征在于：步骤4中所述PCR反应体系主要由寡核苷酸(引物)、4种dNTP、Taq DNA聚合酶、靶序列DNA和PCR反应缓冲液体系组成。

6.据权利要求1所述的一种土壤中反硝化细菌NosZ基因绝对定量检测的引物的扩增方法，其特征在于：步骤4中所述预变形能破坏DNA中可能存在的较难破坏的二级结构，使DNA充分变性，减少DNA复杂结构对扩增的影响，以利于引物更好的和模板结合。

7.一种土壤中反硝化细菌NosZ基因绝对定量检测的引物的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒内的模板DNA经加热至95℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链以便它与引物结合，为下轮反应作准备。

8.根据权利要求7所述的一种土壤中反硝化细菌NosZ基因绝对定量检测的引物的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒内的模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。

9.根据权利要求7所述的一种土壤中反硝化细菌NosZ基因绝对定量检测的引物的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒内的DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火延伸。