[发明专利]一种人类口腔微生物组群结构及组成的研究方法

说明书

本发明公开了一种人类口腔微生物组群结构及组成的研究方法，包括以下步骤：步骤1、收集唾液样本；步骤2、唾液细菌集合DNA提取；步骤3、PCR扩增目标基因片段；步骤4、DGGE电泳；步骤5、差异条带回切测序；步骤6、DGGE图谱及数据分析。该方法采用DGGE技术针对样本人群唾液样本进行唾液微生物组群的多样性，了解人群口腔唾液微生物组群结构及组成。本发明得到以下结论：DGGE能够较为全面的反映口腔微生物群落结构，其操作简便，是一项评估口腔建状况、预估口腔疾病发生的经济、准确的技术。

技术领域

本发明属于医学技术领域，涉及一种人类口腔微生物组群结构及组成的研究方法，具体地说，涉及一种人类口腔不同生长发育阶段微生物组群结构及组成和个体口腔健康状况评估的研究方法，可用以疾病筛查或者口腔亚健康状况的评估和疾病预测。

背景技术

人体体表及体内栖息着大量的微生物，以微生态群落的形式参与人体健康的维持与疾病发生过程，发挥着重要的作用，因此被称为“人类第二基因”。口腔内定植着的微生物组成特定复杂的微生态环境参与宿主口腔健康与疾病的调控过程。稳定平衡的口腔微生态系在维护口腔健康中发挥着至关重要的作用，平衡失调是多种口腔感染性疾病发生发展的始动因子，口腔致病菌过度生长或益生菌生长被抑制，均可导致口腔感染性疾病的发生，甚至引发全身系统性疾病。

微生态环境从“健康”状态转变为“疾病”状态并不是单一或者某几种细菌的单独作用，而是涉及到一个共生菌群，甚至是由于某些不能依靠传统培养技术分离培养的潜在致病菌的作用。变性梯度凝胶电泳技术(Denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)是一广泛应用于口腔微生物组群多样性分析的分子生物学技术，能够针对微生物16SrRNA/16S rDNA片段同时分析同菌斑生物膜中的多个菌种以方便快速了解菌斑生物膜的组成及结构，也能够对健康样本及患病样本的结构多样性进行快速比较，对某种致病条件下的口腔微生物生态变化进行监控。

发明内容

本发明的目的在于提供一种人类口腔微生物组群结构及组成的研究方法。从微生态角度出发采用不同研究方式探究牙列缺失的生理因素对口腔微生态结构多样性的影响，寻找老年人群口腔优势菌群及核心微生物，为老年口腔疾病、全身性疾病的发病病因及临床预防、诊疗的新方法研究提供一定理论依据。

其技术方案如下：

一种人类口腔微生物组群结构及组成的研究方法，包括以下步骤：

步骤1、收集唾液样本：收集目标群体刷牙后12小时、餐后饮后2小时非刺激性唾液样本3ml，冷藏运输2小时内送回实验室，于-80℃条件下冷冻保存用以提取集合DNA。

步骤2、唾液细菌集合DNA提取：采用MasterPure^TM DNA Purification Kit(Epicentre Biotechnologies)提取唾液细菌基因组DNA。

步骤3、PCR扩增目标基因片段：用DreamTaq^TM PCR Master Mix试剂盒对从唾液细菌集合DNA的16SrDNA V3区域进行扩增，引物设计为不同种类细菌的通用引物：上游引物5’端特异性加了GC夹的BAC1其核苷酸序列如SEQ：ID：1所示，下游引物BAC2其核苷酸序列如SEQ：ID：2所示，扩增后细菌V3高变区片段大小约为340bp。PCR反应体系(50μl)：DNA模板100ng，上游引物(25μM)1μl，下游引物(25μM)1μl，预混PCR反应液25μl，用水将整个反应体系补齐。PCR反应参数如下：

第一步：94℃预变性4分钟；

第二步：94℃变性1分钟；

第三步：56℃退火1分钟；

第四步：72℃延伸2分钟；

第二步至第四步循环25次；