[发明专利]用于快速检测卵巢癌肿瘤标志物Legumain的胶体金免疫层析试剂盒及其制备方法

说明书

本发明公开了用于快速检测卵巢癌肿瘤标志物Legumain的胶体金免疫层析试剂盒及其制备方法,所述试剂盒包括PVC底板、样品垫、结合垫、反应垫和吸水垫，PVC底板呈矩形，样品垫和吸水垫分别对称敷设在矩形PVC底板的一组短边上，样品垫与吸水垫之间设置有反应垫，样品垫与反应垫之间还设置有结合垫；反应垫上设置有包被有胶体金标记的鼠源抗LegumainN抗体的检测线和包被有羊抗鼠IgG的质控线。胶体金作为侧向层析试剂盒标记探制备工艺成熟、性能稳定；能够增强检测结果的特异性，消除检测过程中出现的假阳性，检测结果更准确；需要检测的样本量小，适用于广大女性的卵巢癌筛查及家庭自检和床旁快速检测。

技术领域

本发明涉及生物学免疫层析检测方法领域，特别是用于快速检测卵巢癌肿瘤标志物Legumain的胶体金免疫层析试剂盒及其制备方法。

背景技术

卵巢癌是妇科常见的恶性肿瘤，其死亡率居所有妇科恶性肿瘤之首，危害女性健康。由于卵巢癌早期通常无明显症状且缺乏简便有效的早期诊断方法，因出现症状就诊时约70％的患者已为晚期，晚期患者的且5年生存率为20％-30％，而早期患者的5年生存率为70-90％。因此，卵巢癌的早期检出对其治疗方案的选择及改善患者预后有重要作用。

目前，临床上常用的卵巢癌早期检测方法主要有妇科检查、影像学检查和肿瘤标志物检测等。这些方法及相互配合使用时虽然能够对卵巢癌进行准确诊断，但是对设备和操作人员要求较高，提高了检测成本，同时阻碍了卵巢癌早期检测的普及和推广。

肿瘤标志物的检测被广泛用于肿瘤早期筛查，糖类抗原125(carbohydrateantigen125，CA125)是卵巢癌诊断中常用的肿瘤标志物，但是其用于卵巢癌诊断时的特异性较低，易出现假阳性等问题，因而需要找到新的肿瘤标志物来取代它或与其实现互补。

与正常组织相比，Legumain在小鼠和人类多种实体瘤组织中高表达，尤其是在肿瘤细胞、新生血管内皮细胞和肿瘤相关巨噬细胞(Tumor-Associated Macrophages，TAMs)中，而在体外培养的相应肿瘤细胞株中却不表达。Liu等最先报道Legumain与肿瘤发生发展有关。他们通过Western blot和免疫组化分析，发现在多种鼠肿瘤细胞中，Legumain表达增高，而在体外培养的各肿瘤细胞株中则不表达。Liu等还检测了人正常组织及多种实体瘤组织，结果显示在正常组织中，Legumain表达极低，而在多种实体瘤组织中(如乳腺、结肠、肺、前列腺、卵巢肿瘤和中枢神经系统恶性肿瘤)Legumain高表达。

侵袭和转移是恶性肿瘤的播散方式，也是影响肿瘤患者的治疗效果和预后的重要因素。Legumain与整合素形成复合物，在实体肿瘤的低氧和酸性微环境中，具有激活肿瘤细胞Pro-MMP2和Pro-Cathepsin L的功能，促进肿瘤生长、侵袭和转移。为了证实Legumain的表达是否与肿瘤的分化程度、坏死、凋亡及预后相关。Murthy等通过Western blot和免疫组织化学方法，对164例原发性结肠癌、34例远端正常粘膜组织、89例癌旁组织及33例淋巴结转移癌组织样本进行临床病理检测，结果表明，在原发性结肠癌中，Legumain表达明显高于远端正常组织和癌旁组织(P0.05)，但与淋巴结转移癌组织样本无显著差异(P0.05)。同时，Legumain在肿瘤患者瘤体(P＝0.01)或基质中的表达(P＝0.04)水平较低时，其预后较好。Gawenda等、通过免疫组织化学方法研究了432例乳腺浸润癌和128例乳腺非癌组织样本，证实人乳腺癌组织中Legumain高表达，并且与乳腺癌临床病理变化有一定的相关性。Lin(Lin.et.al.,JNCI,2014.)等报道了乳腺癌病人细胞内的Legumain在TRAF6的催化下进行泛素化，然后与HSP90α形成复合体被运输到细胞外随血液循环系统到达远端组织，在远端组织进行活化后促进肿瘤的迁移和扩散，并且已证实乳腺癌病人血清中Legumain的水平与癌症的发展阶段呈一定的相关性。血清中的Legumain水平可以促进肿瘤的侵袭和扩散，用抑制剂或者抗体阻断血清中的Legumain作用可以消除小鼠体内肿瘤的扩散。

发明内容