[发明专利]一种丙二酸的全生物合成的方法

权利要求书

1.一种产丙二酸的重组大肠杆菌，其特征在于，以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主，分模块过量表达来自大肠杆菌的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因、琥珀酸脱氢酶基因、琥珀酸半醛脱氢酶基因、天门冬氨酸酶基因，来自谷氨酸棒杆菌的异源基因天冬氨酸-α-脱氢酶基因，来自铜绿假单胞菌的β-丙氨酸丙酮酸转氨酶基因；

所述分模块过量表达是将琥珀酸半醛脱氢酶基因和β-丙氨酸丙酮酸转氨酶基因融合表达，将天门冬氨酸酶基因和天冬氨酸-α-脱氢酶基因融合表达，将琥珀酸脱氢酶基因和磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因融合表达；

所述磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述琥珀酸脱氢酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述天门冬氨酸酶基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示，所述天冬氨酸-α-脱氢酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述β-丙氨酸丙酮酸转氨酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述琥珀酸半醛脱氢酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

以质粒pRSFDuet-1为骨架载体，连接基因片段琥珀酸半醛脱氢酶基因yne1、β-丙氨酸丙酮酸转氨酶基因pa0123；以质粒pTrc99a为骨架载体，连接基因片段天门冬氨酸酶基因aspa、天冬氨酸-α-脱氢酶基因panD；以质粒pCDFDuet-1为骨架载体，连接基因片段琥珀酸脱氢酶基因sdhC、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因ppc。

2.一种构建权利要求1所述重组大肠杆菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）以质粒pRSFDuet-1为骨架载体，连接基因片段yne1、pa0123，得到重组质粒pRSF-yne1-pa0123；

（2）以质粒pTrc99a为骨架载体，连接基因片段aspa、panD，得到重组质粒pTrc99a-aspa-panD；

（3）以质粒pCDFDuet-1为骨架载体，连接基因片段sdhC、ppc，得到重组质粒pCDF-sdhC-ppc；

（4）将pRSF-yne1-pa0123、pTrc99a-aspa-panD、pCDF-sdhC-ppc共同转入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组大肠杆菌。

3.一种生产丙二酸的方法，其特征在于，将权利要求1所述的重组大肠杆菌接种至含葡萄糖的发酵培养基中发酵生产丙二酸。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，将重组大肠杆菌于35~37℃培养至OD₆₀₀为0.6-0.8时，加入IPTG 诱导。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述诱导是在28~30℃诱导36~60 h。

6.根据权利要求3~5任一所述的方法，其特征在于，以SOB培养基为发酵培养基，

7.权利要求1所述的重组大肠杆菌或权利要求3~6任一所述方法在制备丙二酸中的应用。