[发明专利]一种分离、纯化和固定化组氨酸标签蛋白及牛血红蛋白的新型磁珠的制备方法和应用

说明书

本发明涉及一种可用于分离、纯化和固定化组氨酸标签蛋白、牛血红蛋白的新型磁珠及其制备方法和应用。首先利用共沉淀法制备纳米四氧化三铁磁核，然后在该磁核表面直接修饰上若干种不同的羧基化硅烷偶联剂作为配体，使之可以螯合金属离子。按照本发明方法制得的磁珠不仅磁性好、性质稳定、易分散，而且还具有合成方法简单、易于控制和实现等优点，通过磁珠表面的金属离子与重组蛋白表面组氨酸残基之间强烈的配位作用稳定结合，能够高选择性、高效率的分离纯化His‑tagged蛋白、牛血红蛋白等目标蛋白。

技术领域

本发明涉及生物功能材料技术领域，具体涉及一种可用于分离、纯化和固定化组氨酸标签蛋白、牛血红蛋白的新型磁珠及其制备方法和应用。

背景技术

蛋白质是一类重要的生物大分子，它是一切生命活动的主要承担者和物质基础。对蛋白质的结构功能进行研究并最终实现应用的前提和基础为蛋白质的高效分离纯化。常规的蛋白质分离提取技术通常依赖于蛋白质在溶解性、疏水性、分子大小、表面所带电荷以及特异生物学亲和性上的差异，由此发展出了盐析法、等电点沉淀法、有机溶剂沉淀法等粗分离方法。此类方法虽然操作简便、处理量大，但通常分辨率过低，无法有效的分离出目标蛋白。其他蛋白质精细分离技术还有凝胶层析、亲和层析、离子交换层析等，这些方法普遍存在价格昂贵、处理量少、对设备要求较高、难以大规模应用等问题。因此建立一种高选择性、可大规模应用的蛋白质分离技术是当前迫切且极具发展前景的一项任务。

基于金属螯合层析技术和功能化修饰磁珠发展起来的金属螯合磁珠是提取分离蛋白质的优良方法，这类磁珠表面修饰的功能化基团通过配位作用与金属离子牢固结合在一起，而重组蛋白表面所带的标签蛋白与金属离子之间的配位作用便于高选择性的提取到目标蛋白。这种方法成本相对较低、操作相对简单，在重组蛋白质的纯化中具有明显的优势。目前已有不少金属螯合磁珠被公开报道，也有不少商业化金属螯合磁珠产品，本发明采用新思路用新途径制备了一系列新型磁珠。与以往制备方法相比，本发明方法具有成本低、合成路线简单、效率高等显著优势。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种可用于分离、纯化和固定化组氨酸标签蛋白及牛血红蛋白的新型磁珠的制备方法，该方法具体如下：

(a)保护气氛下将复合铁盐溶于水中，接着加入氨水，调节溶液pH至碱性并升温进行陈化反应，固液分离得到纳米四氧化三铁磁核，将磁核分散在除氧去离子水中，得到磁核溶液；

(b)以A组分和B组分为原料，制备配体溶液；

(c)将步骤(a)制得的磁核溶液与步骤(b)制得的配体溶液混合，调节混合溶液的pH至酸性并升温反应，最后固液分离得到磁珠；

其中A组分为γ-氨丙基三乙氧基硅烷(KH550)或N-β-(氨乙基)-γ-氨丙基三甲氧基硅烷(KH900)，B组分为氯乙酸钠；或者A组分为γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷(KH560)，B组分为亚氨基二乙酸；或者A组分为γ-氨丙基三乙氧基硅烷(KH550)，B组分为亚氨基二乙酸、环氧氯丙烷的混合物。

进一步的，步骤(a)所述复合铁盐为水溶性三价铁盐和水溶性二价铁盐的混合物，两者的质量比为1:1.0-1.4。所述水溶性三价铁盐选自Fe(NH₄)₂·(SO₄)₂或其水合物，所述水溶性二价铁盐选自FeCl₃或其水合物。

进一步的，步骤(a)具体过程如下：首先将去离子水煮沸后密封自然冷却，以便尽可能除去其中的氧；接着在氮气保护下向去离子水中加入复合铁盐使其充分溶解，所得混合物加热至50-70℃后以200-300r/min的速率搅拌20-40min，然后加入适量氨水调节溶液的pH至10-12，所得混合物继续加热至80-90℃，保温陈化0.5-2h，磁吸附分离后用乙醇和除氧去离子水洗涤所得固体至中性，再加入到除氧去离子水中得到磁核溶液。

进一步的，步骤(b)中配体溶液的制备方法具体如下：