[发明专利]6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体及其在制备皮质醇检测试剂中的用途

说明书

本申请涉及6‑磷酸葡萄糖脱氢酶突变体及其在制备皮质醇检测试剂中的用途。具体而言，本申请的6‑磷酸葡萄糖脱氢酶突变体相较于野生型6‑磷酸葡萄糖脱氢酶包含选自以下的一个突变或其组合：D306C、D375C、G426C。使用本申请的6‑磷酸葡萄糖脱氢酶突变体所制备的检测试剂盒，其特异性强、灵敏度高、操作方便、检测时间短、定量准确，适合高通量检测。

本申请要求2019年1月9日提交的201910017764.4和2019年5月21日提交的201910423122.4《6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体及其在制备检测试剂中的用途》的优先权，其通过引用并入此处。

技术领域

本申请涉及生物检测领域，特别是涉及一种突变的酶6-磷酸葡萄糖脱氢酶(简称G6PDH)及其在皮质醇检测试剂盒中的应用。

背景技术

半抗原，某些小分子物质(分子量小于4000Da)，其单独不能诱导免疫应答，即不具备免疫原性，但当其与大分子蛋白质或非抗原性的多聚赖氨酸等载体交联或结合后可获得免疫原性，诱导免疫应答。这些小分子物质可与应答效应产物结合，具备抗原性，它只有免疫反应性，不具免疫原性，又称不完全抗原。

半抗原能与对应抗体结合出现抗原-抗体反应，又不能单独激发人或动物体产生抗体的抗原。它只有免疫反应性，不具免疫原性，又称不完全抗原。大多数多糖、类脂、激素、小分子药物都属于半抗原。如果用化学方法把半抗原与某种蛋白分子(载体)结合，会获得新的免疫原性，并能刺激动物产生相应的抗体。半抗原一旦与蛋白结合，就构成该蛋白质的一个抗原簇。一些比一般半抗原分子量小，但有特异结构的化学活性基团物质(如青霉素、磺胺剂等)，称为简单半抗原。

小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，多采用竞争模式。原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，显色愈浅。小分子激素、药物等ELISA测定多用此法。

皮质醇(Cortisol)结构式如下所示：

皮质醇，亦称氢化可的松，又称氢皮质素或化合物F(compound F)，是从肾上腺皮质中提取出的是对糖类代谢具有最强作用的肾上腺皮质激素(属于糖皮质激素的一种)。

皮质醇是通过肾上腺皮质线粒体中的11β-羟化酶的作用，由11-脱氧皮质醇生成。皮质醇也可通过11-β-羟类固醇脱氢酶(11-β-hydroxysteroid dehydrogenase)的作用变成皮质素。

皮质醇在许多重要生理过程的调节中发挥着重要作用，包括能量代谢、维持电解质和血压平衡、免疫调节、应激反应、细胞增殖和分化已经记忆调节和认知功能等等。血液中皮质醇主要与皮质类固醇结合球蛋白和白蛋白结合，游离的皮质醇只占3-5％，且皮质醇浓度水平每天呈现周期性变化，前半夜达到最低，并在凌晨达到峰值。

血液中测量皮质醇主要用于库欣综合征导致的皮质醇分泌过多和艾迪生病导致的皮质醇缺乏等人类疾病，以及治疗监测(地塞米松抑制疗法和激素替代疗法)。

目前已知的皮质醇检测方法主要有：酶联免疫吸附法、化学发光免疫分析法、高效液相色谱法、气液色谱法、气相色谱法和质谱联用等。但这些检测方法均存在较多的缺陷，如化学发光尽管灵敏度较好，但需要配套的专用设备，投入使用成本较高不利于推广。在临床检测诊断过程中，以均相酶免疫法(EMIT)和胶乳增强免疫比浊法检测为主。

均相酶免疫测定的原理：在液体均相反应体系中，酶标记抗原(如G6PDH-皮质醇)与非标记抗原(皮质醇)，竞争与定量的抗体(皮质醇抗体)进行结合，当抗体与非标记抗原结合越多，酶标记抗原释放的活性就越多，酶催化底物NAD+生成NADH就越多，在340nm波长下检测NADH的吸光度变化，即可推算出液体中皮质醇的含量。