[发明专利]一种体外转录mRNA的核苷酸分子、呈递细胞及应用

说明书

本发明提供一种体外转录mRNA的核苷酸分子、呈递细胞及应用，涉及生物技术领域，本发明提供的所述核苷酸分子至少具有SEQ ID NO.3所示的核酸序列；至少转录具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列或/和具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的mRNA；所述呈递细胞是负载有体外转录mRNA的核苷酸分子的树突状细胞，所述体外转录mRNA的核苷酸分子可以用于制备mRNA筛选或/和评估模型，或直接用于筛选或/和评估抗原表位或mRNA，本发明提供的体外转录mRNA的核苷酸分子表达的mRNA稳定度更高，持续表达时间增长，成本低，普适性广，解决了目前的肿瘤抗原疫苗只能对单一的抗原进行呈递的技术问题。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种蛋白异常表达疾病抗原及应用。

背景技术

随着生物医学研究的进步，越来越多的与蛋白异常表达相关的疾病被发现。其中肿瘤蛋白质异常产生的抗原主要有肿瘤相关抗原(Tumor associated Antigen，TAA)和肿瘤新抗原(Neo-antigen)。目前抗体均通过结合位于细胞表面或细胞外的靶蛋白来实现其治疗作用。然而细胞外靶蛋白的数量非常有限，受此限制，市场已有抗体药物识别的目标蛋白高度集中，这一方面大大限制了抗体药物的适应症范围，很多疾病缺乏合适的抗体类药物；另一方面，有限的标靶也导致制药公司的研发工作高度同质化，造成行业内的过度竞争和社会资源的浪费；此外，受限于常规研究方案的通量，往往只能单次测试一种目标蛋白，增加了研发成本和研发时间。因此，一种能够方便、高效、安全、特异性、并双方向(包括活化和抑制)地调控机体免疫系统识别细胞内蛋白的方法，将开启生物制药产业发展的新阶段。

以用质粒为代表的DNA或者病毒为媒介，在细胞内表达功能蛋白是基因治疗的常用手段，该方法虽然具有较高的转染和表达效率，但却无法避免DNA与靶细胞的基因组发生重组，而导致其他疾病的风险。举例而言，外源DNA可能被插入某个正常的基因内部，从而导致突变甚至完全破坏该基因的表达，如果这个被插入的基因是比较重要的功能基因，这种改变将对细胞功能造成重大破坏，甚至导致细胞转化产生癌症。基于DNA的质粒或病毒为工具，在理论上无法避免相关的致癌风险，这也是基因治疗方法未能充分推广的重要原因。相比而言，RNA进入细胞后，无法反转录成DNA,因此在理论上不会对细胞基因组的稳定性造成破坏，可以说，RNA疗法从根本上规避了基因疗法的致癌风险，更适合临床用药的安全需求。此外，DNA需要进入细胞核才能被转录和表达，转染难度较大，且在一定程度上需要细胞处于活跃的分裂周期才能进入细胞核；而RNA只要进入细胞质内就可以表达，不需进细胞核转录，也不依赖细胞周期，同样的转染条件下RNA比DNA在胞内表达的效率更高，在临床应用的难度更小。

尤其是mRNA由于其低免疫原性、易于生产的优势，在基因治疗中具有巨大的治疗潜力，而目前通常用于肿瘤治疗领域，且均根据肿瘤相关抗原(Tumor associatedantigen,TAA)和肿瘤新抗原(Neo-antigen)进行设计，鉴于肿瘤异质性的存在，现有技术单次可设计的抗原数量较少，结构较为简单，mRNA稳定性和抗原呈递能力较差，且受限于蛋白选择，需要使用特定的肿瘤患者进行试验，大大增加了研发的成本及风险周期。

例如中国专利文献CN107793484A公开了一种重组肿瘤抗原及其制备方法和编码核酸及其应用，其重组抗原包含了经过密码子优化后的人GP96基因的信号肽，人AKR1B10基因的编码序列，人LAMP1基因信号序列，以及A64的ployA结构区域。该发明将经过优化后的AKR1B10重组抗原mRNA转染到未成熟的DC细胞中，经细胞因子诱导成熟后，得到成熟的树突细胞肿瘤疫苗DC-AKR1B10。以该肿瘤疫苗刺激机体，能够产生细胞毒性T细胞，在不引起自身免疫的情况下即可引起有效的抗肿瘤免疫反应。但是该方法获得单一的肿瘤抗原，需要AKR1B10蛋白高表达患者作为试验样本，试验对象的选择范围窄；由于使用全长蛋白，因此获得的疫苗无法判断是由哪一部分表位呈递激活，且mRNA的稳定性较差。