[发明专利]一种酶联免疫斑点检测试剂盒及其检测方法

说明书

本发明公开的一种酶联免疫斑点检测试剂盒，包括实验孔：包含anti‑CD28、IL‑2的培养基，多肽，细胞悬液；阴性对照：包含anti‑CD28、IL‑2的培养基，DMSO，细胞悬液；阳性对照：包含anti‑CD28、IL‑2的培养基，PMA+Ionomycin，细胞悬液；标准曲线：包含anti‑CD28、IL‑2的培养基，各浓度anti‑CD3，细胞悬液。其优点在于，提高酶联免疫斑点检测方法的灵敏度，并确保能够得到稳定可靠的检测结果。

技术领域

本发明属于酶联免疫斑点检测技术领域，具体为一种酶联免疫斑点检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

酶联免疫斑点检测ELISpot(Enzyme-Linked ImmunoSpot assay)是目前应用最为广泛的单细胞功能检测方法之一。在肿瘤疫苗研制上，功能性免疫学检测是疫苗研制和临床试验的基本组成部分，ELISpot检测作为一种强有力的实验技术，主要应用于新的免疫原性靶点的鉴定、验证抗原特异性T细胞的存在、评价疫苗诱导的免疫应答，有助于了解疫苗的免疫原性、效力和有效性。

ELISpot只需要相对较低数量的T细胞就能够简单快速地检测肽特异性T细胞反应。ELISpot分析通常被认为是一种高度敏感的方法，可以检测10000个细胞中的一个。尽管ELISpot检测具有很高的敏感性，但检测患者或健康供体外周血单个核细胞中新抗原特异性T细胞的免疫应答仍然非常困难，因为这些T细胞的频率可能非常低。

ELISpot分析将产生潜在的重要数据，对进行纵向随访的免疫反应监测而言，在所有检测中获得可比结果极其重要，目前市面上的ELISpot试剂盒无法解决此问题。

发明内容

为解决现有技术中酶联免疫斑点检测试剂盒无法更为有效刺激T细胞，从而无法获得更高灵敏度，以及检测数据结果不能达到较佳地稳定可靠的问题，本发明提供了一种酶联免疫斑点检测试剂盒及其检测方法，实现的目的为采用抗体和细胞因子等共同刺激T细胞，提高酶联免疫斑点检测方法的灵敏度，缩短体外刺激时间，并确保能够得到稳定可靠的检测结果。

为了实现上述目的，本发明提供的技术方案，本发明提供的一种酶联免疫斑点检测试剂盒，包括实验孔：在实验孔内加入96μL待测PBMC细胞的培养基，4μL多肽，多肽中每条肽浓度为1-10μg/ml，以及100μL浓度为1-5×10⁶/ml待测PBMC细胞悬液，终体积为200μL；该培养基中包含anti-CD28、IL-2，anti-CD28在该培养基中的浓度为0.1-5μg/ml，IL-2在该培养基中的浓度为1-30U/ml；

阴性对照：在阴性对照孔内加入99μL待测PBMC细胞的培养基，1μLDMSO，以及100μL浓度为1-5×10⁶/ml待测PBMC细胞悬液，终体积为200μL；该培养基中包含anti-CD28、IL-2，anti-CD28在该培养基中的浓度为0.1-5μg/ml，IL-2在该培养基中的浓度为1-30U/ml；

阳性对照：在阳性对照孔内加入96μL待测PBMC细胞的培养基，4μLPMA+Ionomycin，以及100μL浓度为1-5×10⁶/ml待测PBMC细胞悬液，终体积为200μL；该培养基中包含anti-CD28、IL-2，anti-CD28在该培养基中的浓度为0.1-5μg/ml，IL-2在该培养基中的浓度为1-30U/ml；

含有anti-CD3梯度浓度的标准曲线：在各标准曲线孔分别加入95μL待测PBMC细胞的培养基，5μL各浓度anti-CD3，100μL浓度为1-5×10⁶/ml待测PBMC细胞悬液，每个标准曲线孔内液体的终体积为200μL，得到多个含有anti-CD3梯度浓度的标准曲线孔；该培养基中包含anti-CD28、IL-2，anti-CD28在该培养基中的浓度为0.1-5μg/ml，IL-2在该培养基中的浓度为1-30U/ml；所述anti-CD3浓度的梯度设置为以0.001-0.005μg/ml浓度开始，连续倍比稀释。