[发明专利]一种检测杂色曲霉毒素的酶联免疫试剂盒制备

说明书

本发明为检测杂色曲霉毒素的酶联免疫试剂盒及其检测方法，其检测灵敏、准确、快速，操作简便、特异性强，适用于大批样品的检测。所述试剂盒包括：包被杂色曲霉毒素抗原的酶标板、杂色曲霉毒素标准品、杂色曲霉毒素抗体工作液、杂色曲霉毒素酶标二抗工作液、底物液A、底物液B、终止液、浓缩稀释液和浓缩洗涤液。检测杂色曲霉毒素的酶联免疫试剂盒的原理是固相间接竞争酶联免疫反应，把提取的样品、酶标二抗工作液和抗体工作液加入对应的酶标板微孔中，孵育一段时间后，洗板加入底物液A、底物液B，在酶的作用下显色剂呈现蓝色，加入终止液，颜色由蓝色变为黄色。显色的深浅与标准品或样品中杂色曲霉毒素的含量成反比例关系。该方法可直接用于检测乳制品中杂色曲霉毒素的残留量。

技术领域

本发明涉及兽药残留检测技术领域，特别是检测乳制品中杂色曲霉毒素的酶联免疫试剂盒。

背景技术

杂色曲霉毒素（ST）是致癌性真菌毒素之一。其毒性虽弱于黄曲霉毒素，但由于主要的产毒菌杂色曲霉、构巢曲霉等在食品饲料中分布广，产毒比例高，故对人、畜、家禽的危害不容忽视。杂色曲霉素(Sterigmatocystin)主要是杂色曲霉(Aspergillus versicolor)和构巢曲霉(Aspergillus nidulans)的最终代谢产物，同时又是黄曲霉(Aspergillusflavus)和寄生曲霉(Aspergillus parasiticus Speare)合成黄血霉毒素过程后期的中间产物。据报道，感染了杂色曲霉的玉米在27℃的环境下，21天可产生杂色曲霉毒素12g/kg以上。杂色曲霉毒素的大鼠经口LD 50以mg/kg体重计，雄性为166、雌性为120，小鼠为800以上。猴经腹腔注射LDso为32。由LDso值可看出，灵长类(猴)对杂色曲霉毒素的敏感性比啮齿类高。杂色曲霉毒素引起的致死性病变主要为肝、肾实质器官坏死。杂色曲霉毒素具有致癌性，还可使枯草杆菌及小鼠细胞发生突变反应。ST在自然界中广泛存在，因结构与黄曲霉毒素相似，因此其毒性和致癌性受到世界各国的高度重视。杂色曲霉毒素杂色曲霉毒素杂色曲霉毒素

酶联免疫吸附法是一种准确、可靠、快速、特异的检测方法，适合于大批样品的快速筛选，近年来已广泛应用于食品安全检测行业。本发明旨在建立一种检测杂色曲霉毒素的酶联免疫试剂盒及其检测方法。

发明内容

为了克服色谱法的不足，本发明提供一种检测杂色曲霉毒素的酶联免疫试剂盒及其检测方法。该方法灵敏、准确、快速，操作简便、特异性强，适用于大批样品的快速检测。

本发明检测杂色曲霉毒素的酶联免疫试剂盒，包括酶标板、杂色曲霉毒素标准品、杂色曲霉毒素抗体工作液、杂色曲霉毒素酶标二抗工作液、底物液A、底物液B、终止液、浓缩稀释液和浓缩洗涤液。

本发明检测杂色曲霉毒素的酶联免疫试剂盒的制备，包括以下步骤：酶标板的制备、杂色曲霉毒素标准品的制备、杂色曲霉毒素抗体工作液的制备、杂色曲霉毒素酶标二抗工作液的制备、底物液A的制备、底物液B的制备、终止液的制备、浓缩稀释液的制备和浓缩洗涤液的制备。

其进一步特征在于：所述的酶标板经由杂色曲霉毒素抗原包被制备，具体步骤是将杂色曲霉毒素半抗原与载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)偶联得到包被抗原，用0.05 mol/LpH 9.6的碳酸盐(CBS)缓冲液作为包被液，将杂色曲霉毒素包被抗原稀释成1：40000比例，100 μL/孔，37℃避光孵育2 h，取出酶标板甩掉板内液体，加入经稀释的浓缩洗涤液300 μL/孔，洗板2次，30 s/次，然后加入0.5%牛血清白蛋白(BSA)封闭液，150 μL/孔，37℃放置1.5 h，甩掉封闭液直接拍干，拍干后的酶标板放置恒温间(25℃)晾干，抽检合格后将酶标板真空密封于4℃条件下保存。

杂色曲霉毒素标准品浓度分别为0 mg/kg、0.1mg/kg、0.3 mg/kg、0.9 mg/kg、2.7mg/kg、8.1 mg/kg。

所述杂色曲霉毒素抗体工作液是采用杂色曲霉毒素人工抗原免疫小鼠得到单克隆抗体，用抗体稀释液稀释成1：60000比例制备。