[发明专利]一种通过耳道念珠菌细胞壁重构来评价中药单体抗真菌作用的方法

说明书

一种通过耳道念珠菌细胞壁重构来评价中药单体抗真菌作用的方法，包括将中药单体加入至评价菌液，孵育12h后用无菌PBS洗涤一次，再用无菌PBS配制的质量分数为2%的BSA封闭1小时，再然后用无菌PBS洗涤一次；接下来加入100ul的β‑葡聚糖抗体，放在4°C冰箱进行染色4h，染色结束后，用无菌PBS洗涤2次，再用cy3单抗鼠标记IgG在室温下避光染色1小时，然后用无菌PBS避光洗涤3次后用1ml的无菌PBS进行避光重悬，避光震荡混匀后用流式细胞仪进行葡聚糖荧光暴露强度的检测；或者用流式细胞仪进行几丁质荧光暴露强度的检测；或者用倒置荧光显微镜记录β‑葡聚糖与几丁质荧光图像。本发明利用耳道念珠菌细胞壁重构来评价中药单体抗真菌作用，具有临床意义。

技术领域

本发明涉及一种通过耳道念珠菌细胞壁重构来评价中药单体抗真菌作用的方法。

背景技术

耳道念珠菌(Candida auris)自从2009年被发现至今,已对全球性人类健康构成了严重威胁。近年来耳道念珠菌感染日益常见，特别是在长期住院或免疫功能低下的患者中，严重者可致死亡。目前，相比于耐药性细菌感染或病毒爆发，耳道念珠菌感染较少受重视，耳道念珠菌耐药性机制研究和新型抗真菌药物的研发尚无可观性进展。在此情况下，耳道念珠菌对有限的抗真菌药物耐药性的增加是一个当今社会必须面临的严重问题，多重耐药耳道念珠菌的出现是一种全球健康威胁。念珠菌引起的侵袭性真菌感染对全球卫生保健来说仍然是非常棘手的问题。耳道念珠菌自2009年出现以来，因其对人类的致死性（总死亡率40-60%），导致它逐渐成为一种超级真菌致病菌。耳道念珠菌，据报道令人难以置信的是对于更常见的合成抗真菌药物，其耐药性来自多药耐药（MDR）的比例占40%到≥2和4-10%。

传统的中药单体或植物化合物是筛选抗真菌药物的一个很有前景的领域。THMS（Traditional herbal monomers，传统草药单体）中具有抗真菌活性的化学物质包括苯丙类化合物、醌类化合物、黄酮类化合物 、萜类化合物、生物碱等，其中一些具有较强的抗真菌作用，最低抑菌浓度为≤32g/mL。与传统的抗真菌药物相比，大多数THMS对念珠菌的MDR发生率相对较低。为了能进一步提高THMS的抗真菌效果（特别是MIC32g/mL），联合用药是一种有效、抗真菌增殖策略。在中国，传统药物往往使用含有一种以上中药单体的汤剂来治疗细菌和/或真菌感染。

假设汤剂含有多个有效成分的汤的潜在作用方式与药物组合有关。因此，研究THMs之间的联合比与传统合成抗真菌药物的联合应用对研究其抗真菌作用具有更重要意义。然而，体内外药物联合的定义往往不一致，这可能是由于复杂的体内环境（尤其是宿主免疫防御）对药物抗真菌疗效的影响（单独或联合）。

耳道念珠菌细胞壁由β-葡聚糖、甘露糖蛋白和少量的壳多糖(几丁质)组成。耳道念珠菌的细胞壁蛋白参与白念珠菌的黏附和侵入。细胞壁是耳道念珠菌最外层结构，完整的细胞壁呈刚性结构，可以作为物理化学屏障保护细胞，并可以调节营养物质的吸收和代谢产物的分泌。耳道念珠菌感染时，是通过其细胞壁的主要组分与宿主细胞上相应受体的相互作用介导对靶细胞的损伤。因此，研究针对细胞壁的抗耳道念珠菌药物对于防治耳道念珠菌感染具有重要意义。

耳道念珠菌细胞壁作为第一个接触点，是一个动态的、高度构成的细胞器，也是最早感知和响应由药物攻击引起的环境线索的部位。在大量的病原体分子模式(PAMP时)共价链接到细胞壁,β-1,3-glucan通常是被埋在外层由连接有N-/O-的甘露糖基化和磷酸化的甘露糖基化装饰的糖基化的甘露糖蛋白下面 。当感知外部刺激(如药物攻击)，内部β-葡聚糖将会被暴露，这个过程叫做细胞壁重塑/重排(CWR)，随后激活固有免疫防御。

发明内容

本发明的目的在于提供一种通过耳道念珠菌细胞壁重构来评价中药单体抗真菌作用的方法。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种通过耳道念珠菌细胞壁重构来评价中药单体抗真菌作用的方法，包括下列步骤：