[发明专利]重组人奥克纤溶酶的制备方法

说明书

本发明提供了一种重组人奥克纤溶酶的制备方法，具体地，所述制备方法通过将重组人奥克纤溶酶原通过阳离子层析、酶切活化和疏水层析等步骤，得到高纯度的重组人奥克纤溶酶。本发明的方法步骤简单、蛋白收率高、产品纯度高，适合产业化生产。

技术领域

本发明涉及重组蛋白质领域，具体涉及重组人奥克纤溶酶的制备方法。

背景技术

人纤溶酶由791个氨基酸组成，分子量约为88kD，形成两条链，重链和轻链之间以二硫键连接。重组人奥克纤溶酶是截取人纤溶酶C端249氨基酸形成，分子量约为27.2kD。

人纤溶酶原是人体纤溶系统的关键成份之一。活化后的纤溶酶具有丝氨酸蛋白酶活性，能够降解多种蛋白，如层粘连蛋白、纤连蛋白和胶原蛋白等。此外，纤溶酶可以激活基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinase，MMP)，激活后的MMP也可以参与降解细胞外基质蛋白。纤溶酶通过水解玻璃体后膜和视网膜基底膜之间的粘附分子，使玻璃体和视网膜分离，达到治疗玻璃体黄斑粘连和黄斑牵引的目的。

重组人奥克纤溶酶是一种截短的纤溶酶，它只保留纤溶酶原C端249个氨基酸。重组人奥克纤溶酶具有纤溶酶的蛋白水解催化活性，并且比人纤溶酶更加稳定。

重组人奥克纤溶酶重链19个氨基酸(此肽链虽然短，但是来自于人纤溶酶的重链，故依然称为重链)，轻链230个氨基酸，重链和轻链之间通过两条二硫键相连，此外，轻链内还有4条二硫键。

对于重组人奥克纤溶酶的制备，中国专利2003801087731公开了微纤溶酶原和小纤溶酶原表达载体的构建，用pPICZɑ-MPLG1转化毕氏酵母，筛选高表达菌株X33-MPLG1-5#，纯化步骤包括：离子交换层析、疏水层析和亲和层析三步获得纤溶酶原，再通过定量活化、疏水层析纯化获得微纤溶酶，但其纯化步骤长，操作繁琐，收率低。

因此，本领域迫切需要开发出一种步骤简单、蛋白收率高、产品纯度高的重组人奥克纤溶酶的制备方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种步骤简单、蛋白收率高、产品纯度高的重组人奥克纤溶酶的制备方法。

本发明提供了一种重组人奥克纤溶酶制备方法，包括步骤：

(a)提供重组人纤溶酶原溶液；

(b)将所述重组人奥克纤溶酶原溶液通过阳离子层析柱，得含有重组人奥克纤溶酶原的洗脱液；

(c)将氨甲环酸加入所述洗脱液，并加入纤溶酶原活化剂进行酶切反应，得初级酶切液；和

(d)将所述初级酶切液通过疏水层析柱，得到纯化后的重组人奥克纤溶酶溶液。

在另一优选例中，在步骤(d)之前，还包括步骤：

(d1)将所述初级酶切液用稀释液稀释；和/或

(d2)用滤膜过滤，得滤液；

然后将所得液体进行步骤(d)。

在另一优选例中，所述重组人奥克纤溶酶原溶液包括毕赤酵母或酿酒酵母发酵上清液。

在另一优选例中，所述重组人奥克纤溶酶原包括具有SEQ ID No.:1所示氨基酸序列的肽段。

在另一优选例中，所述重组人奥克纤溶酶原溶液具有一个或多个下述特征：

1)所述重组人奥克纤溶酶原溶液中，重组人奥克纤溶酶原浓度为0.01-10g/kg，较佳地，0.02-8g/kg，更佳地，0.03-6g/kg；

2)所述重组人奥克纤溶酶原溶液的pH为5-7，较佳地，5.5-6.5；