[发明专利]虫害胁迫下红椿叶和茎组织的内参基因及其引物和应用

说明书

本发明公开了虫害胁迫下红椿叶和茎组织的内参基因及其引物和应用。本发明筛选表达丰富且相对稳定的17个候选内参基因并设计其引物，利用麻楝蛀斑螟啃食后的红椿叶和嫩茎样品的cDNA为模板进行候选内参基因的qPCR扩增，得到CP值；采用GeNorm、NormFinder和BestKeeper这三个软件对候选内参基因的稳定性进行评价；获得虫害胁迫下红椿叶组织的内参基因PP2C59和UBC5B，虫害胁迫下红椿茎组织的内参基因Actin‑7和UBC5B；本发明的内参基因提高了红椿在麻楝蛀斑螟胁迫下相关基因表达量分析研究的稳定性和可靠性，填补了红椿虫害研究领域中缺少内参基因的空白。

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及虫害胁迫下红椿叶和茎组织的内参基因及其引物和应用。

背景技术

红椿(Toona ciliata)，隶属楝科(Meliaceae)香椿属(Toona)，为国家Ⅱ级重点保护野生濒危植物，广泛分布于中国的华南、华中地区以及北亚热带的南缘。红椿树干通直，材质优良，心材红褐色，纹理优美，是建筑、家具、室内装饰良材，具有很大的开发潜力，素有“中国桃花心木”之称。

发明人课题组前期研究中发现，红椿在早期生长过程中极易遭到名为麻楝蛀斑螟(Hypsipyla robusta Moore)嫩茎取食危害，直接导致枝条中空、断折，从而形成多头树甚至导致幼树死亡，造成红椿难以成材乃至致命的伤害。若不能有效地解决麻楝蛀斑螟对红椿的侵害，该树种将不能大范围推广，严重制约了该速生阔叶树种的可持续发展。针对防治麻楝蛀斑螟的方法依旧在不断研究和试验当中，若单纯地依靠化学农药防治，是以人力、成本和环境为代价的，并且在大范围营林生长中并不适用。研究表明植物在受到害虫侵袭后，植物会感知和启动体内的各种防御信号物质，释放激发子，被植物体内的特异性蛋白识别，导致第二信使(钙离子)流动，产生一系列复杂的诱导抗虫性化学反应，诱导相关防御基因的表达，从而达到防御害虫的效果。

基因表达分析是植物分子生物学领域研究中重要手段之一，在探求基因模式、调控机理、揭示植物内部奥秘等方面有至关重要的作用。研究基因表达的方法有很多，如Northern，microarray，实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)和高通量测序等，其中荧光定量PCR应用最为广泛，它具有高灵敏度，准确性、特异性等特点，是监测整个PCR过程的有力工具。但是荧光定量结果通常受到多个错误来源的影响，如起始材料的量，RNA的完整性，逆转录和qRT-PCR扩增等。因此，为了获得准确的qRT-PCR分析结果，需要一个表达稳定的内参基因进行校正和标准化，从而控制样品内部和样品间不必要的误差。内参基因的表达具有时空特异性，没有一个内参基因可以在所有的试验条件下都能持续的稳定表达，因此内参基因的选取必须具有目的性，针对特定实验条件筛选出特定实验条件下表达稳定的基因才能保证实验结果的准确性和严谨性。

目前，关于红椿内参基因的开发筛选的研究报道一片空白，若要对红椿虫害防御机制或相关分子生物学机制进行研究，内参基因的开发和筛选至关重要。

发明内容

本发明针对现有技术中缺少对红椿基因表达量分析的有效校正和标准化的内参基因的不足，提供虫害胁迫下红椿叶和茎组织的内参基因及其引物和应用。

本发明通过分析红椿转录组数据，进行内参基因的开发；以候选内参基因的序列为模板，设计实时荧光定量PCR的内参基因扩增引物，选取红椿在麻楝蛀斑螟幼虫啃食胁迫条件下的材料进行实时荧光定量PCR；通过△Ct、GeNorm、NormFinder、BestKeeper对获得的荧光定量PCR数据进行统计分析，分别筛选出麻楝蛀斑螟胁迫下叶和嫩茎中表达稳定的内参基因，获得适用于红椿在麻楝蛀斑螟胁迫下叶和嫩茎中表达稳定的内参基因及其引物，克服了传统看家基因的基因的缺点和不足。

因此，本发明的第一个目的是提供虫害胁迫下红椿叶组织的内参基因，为内参基因PP2C59和UBC5B，所述的内参基因PP2C59的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述的内参基因UBC5B的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。