[发明专利]提升胶霉毒素生物合成基因表达水平的CRISPR/dCas9载体及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了提升胶霉毒素生物合成基因表达水平的CRISPR/dCas9载体及其构建方法和应用。本发明首次公开利用CRISPR/dCas9对埃德菌胶霉毒素生物合成基因进行特异性转录调控，构建了提升胶霉毒素生物合成基因表达水平的pLX‑sgRNA‑pG重组载体和pCDNA‑pGPD‑dCas9‑VP64‑cbx重组载体，建立了一种适用于深海真菌埃德菌的CRISPR/dCas9特异性转录调控体系，从而促进埃德菌FS110胶霉毒素生物合成的转录调控，为获得更多具有显著生物学活性的胶霉毒素类衍生物奠定分子生物学基础。

技术领域

本发明属于生物化学和分子生物学技术领域，具体涉及提升胶霉毒素生物合成基因表达水平的CRISPR/dCas9载体及其构建方法和应用。

背景技术

深海真菌埃德菌Dichotomomyces cejpii FS110是一种来源于深海的子囊菌，该真菌能产生种类丰富的次级代谢产物以适应深海环境。胶霉毒素是一类具有抗菌、抗肿瘤及抗免疫抑制等生物学活性的二酮哌嗪类化合物，前期已经有超过30种胶霉毒素类化合物及其衍生物从埃德菌FS110中发掘出来，其中还包括结构罕见的胶霉毒素类二聚体化合物。其中大部分胶霉毒素类化合物具有较显著的抗肿瘤活性，胶霉毒素类化合物衍生物Plinabulin已经用于临床 III期治疗非小细胞肺癌，因此胶霉毒素类化合物在生物医药领域有很好的应用前景。在此基础上，我们完成了对埃德菌FS110的全基因组测序，并预测了其胶霉毒素生物合成基因簇gli cluster，并对关键胶霉毒素部分生物合成功能基因包括GliG、GliI和GliO进行了体外生化功能验证。但是目前由于部分胶霉毒素类化合物及其衍生物产率较低，不利于其后期的大规模应用。CRISPR/dCas9-VP64系统由于其载体构建简单、转录调控效率较高广泛应用于哺乳动物细胞、酵母、斑马鱼等物种目的基因生物表达水平的提升。但目前CRISPR/dCas9-VP64系统在丝状真菌目的基因表达水平提升方面的研究鲜见报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供适用于深海真菌埃德菌FS110的提升胶霉毒素生物合成基因表达水平的CRISPR/dCas9载体及其构建方法和应用。

本发明的第一个目的是提供一种提升胶霉毒素生物合成基因表达水平的CRISPR/dCas9 载体的构建方法，包括以下步骤：

a.以pGPD启动子为模板，利用引物pGPD F和pG R进行PCR扩增得到片段1；

所述的pGPD启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的引物pGPD F的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述的引物pG R的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

b.以pLX-sgRNA载体为模板，利用引物pG F和sgRNAR进行PCR扩增得到片段2；

所述的引物pG F的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述的引物sgRNAR的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

c.将步骤a得到的片段1和步骤b得到的片段2混合作为模板，以引物pGPD F和sgRNA R为引物进行融合PCR，得到融合片段3；

d.对融合片段3、pLX-sgRNA载体分别进行XhoI和NheI双酶切，酶切后用T4 DNA连接酶连接，得到pLX-sgRNA-pG重组载体；

e.将萎锈灵抗性基因cbx通过同源重组整合至pCDNA-dCas9-VP64载体得到pCDNA-dCas9-VP64-cbx重组载体，然后再将pGPD启动子片段通过同源重组插入该重组载体中替换CMV启动子，得到pCDNA-pGPD-dCas9-VP64-cbx重组载体；pLX-sgRNA-pG重组载体和pCDNA-pGPD-dCas9-VP64-cbx重组载体即为提升胶霉毒素生物合成基因表达水平的CRISPR/dCas9载体。